Отзывы праймер люмене: Праймер Lumene Nordic Chic осветляющий и увлажняющий

Сегодня мой отзыв о Becca Backlight Priming Filter, очень симпатичном подсвечивающим и выравнивающем праймере для макияжа. Это не самый мой любимый подсвечивающий праймер, но средство, безусловно, очень приятное и достойное.

Вообще я большой фанат косметики Becca, среди декоративки у меня больше всего продукции именно этого бренда (я, правда, уже практически про весь свой «арсенал» рассказала, осталось только написать про вельветовый праймер и подсвечивающий консилер). Поэтому тут я с вопросом к любителям косметики этого бренда, какие средства от Бекки у вас любимые? Что еще такого супер-классного можно попробовать у бренда (расширяю виш-лист).

Состав

Если говорить о составе праймера Becca Backlight Priming Filter, то тут все в общем-то «праймерно-стандартно» – смягчители, загустители, структурообразователи, слюда (дает как раз подсвечивающее перламутровое сияние). Плюс, есть даже немного «ухода» – экстракт солодки и витамин Е (увлажняют и успокаивают кожу, выступают в роли антиоксидантов), а также пантенол (смягчает и заживляет кожу).

Как видите, праймер достаточно легкий, на водной основе, не силиконистый, то есть ждать от праймера полноценный эффект блюра, конечно же, не стоит. Это не такое средство (на всякий случай уточню).

Использование

Теперь давайте я расскажу по поводу использования праймера Becca Backlight Priming Filter. По сути есть три способа использования этого праймера:

• В качестве базы под тональный или пудру. Это в общем-то мой самый любимый способ использования праймера Becca. Далее в отзыве я расскажу об этом способе более подробно. Однако стоит учитывать важный момент, праймер «дружит» только с легкими тональными, плотные маскирующие могут «съесть» все сияние, которое дает праймер;
• В качестве «апргрейда» для тонального. Тут все просто – просто смешиваем тональный и праймер для получения сияющего финиша;
• В качестве хайлайтера. В этом плане праймер дает очень деликатное естественное сияние (совершенно не яркое).

Сам по себе праймер Becca Backlight Priming Filter достаточно комфортный в использовании, он очень легкий, «флюидообразный» по текстуре, не ощущается на лице, не лежит маской, не забивает и не подчеркивает поры. У праймера телесно-перламутровый оттенок, который не дает цвета на коже.

Праймер придает коже очень свежее «отдохнувшее» сияние, подсвечивая кожу (причем сияние не новогоднее, а достаточно нежное и благородное). Праймер не блюрит кожу, лишь совсем немного выравнивает поверхность и как бы сглаживает ее (за счет светоотражающих частичек). Плюс, маскирует мелкие неглубокие поры. Увеличения «сроки жизни» тонального с этим праймером я не заметила.

Если сравнивать праймеры Becca Backlight Priming Filter и Becca First Light Priming Filter, то мой голос однозначно уходит в пользу второго (за прошлый году у меня ушло несколько флакончиков фиолетового праймера, в то время как золотой закончился у меня буквально на днях, так как я использовала его больше для вечернего макияжа). Хотя это, конечно же, исключительно дело вкуса. Backlight, как мне кажется, дает более выраженный блеск, он ярче, в нем присутствуют небольшие сияющие частички (которые при желании все-таки можно заметить и без микроскопа), First Light более деликатный в этом плане, он дает более тонкое сияние «изнутри» без видимого шиммера.

Заключение

Вот и весь мой отзыв о праймере Becca Backlight Priming Filter. В общем-то мне праймер очень даже нравится, но моим мега-фаворитом он не стал (в этом плане мое сердце принадлежит праймерам Becca First Light и Hourglass). Рекомендую его тем, кто ищет легкие текстуры для макияжа и предпочитает сияющие и влажные финишы.

1 4.9 из 5 на основе 30 оценок

ОЦЕНИТЕ ПРОДУКТ ( 30 )

4.9 / 5

Camelina + Strobe — Светящаяся грунтовка — Seraphine Botanicals

Как видно на НЕЙЛОНЕ

Camelina + Strobe — Luminizing Primer
(гидратант lumineux)

Утомленная кожа мгновенно оживает с этой естественной формулой, усиливающей сияние. Наша осветляющая праймер обеспечивает гладкую, блестящую основу для любого макияжа и придает тусклый, землистый цвет лица легким переливчатым оттенком.Содержит увлажняющий Rose Hydrosol и богатое питательными веществами Camelina (Gold Of Pleasure) Seed Oil , чтобы помочь коже достичь шелковистого сияния и сияния.

Указания: Нанесите небольшое количество на палец, нанесите на все лицо и шею и аккуратно растушуйте по линии роста волос. Наносите под тональную основу или самостоятельно для легкого сияния. Для большей интенсивности нанесите его поверх тонального крема.

• Веганский
• Без парабенов
• Без минерального масла
• Без фталатов
• Без глютена
• С водой из цветов розы
• С маслом семян камелины (золото удовольствия)
• Гипоаллергенный
• Некомедогенный

Если вам понравился, почему бы не попробовать другой оттенок Meadowrose + Strobe!

ИНГРЕДИЕНТЫ / ИНГРЕДИЕНТЫ: вода (аква) **, цветочная вода роза дамасцена *, глицерин *, триглицерид каприловой / каприновой *, изононилизононаноат, масло семян камелины сативы (золото удовольствия) *, кокоглюкозид *, диметикон , цетеариловый спирт, глицерилстеарат *, кросс-полимер диметикон / винилдиметикон, изогексадекан, диметилсилилат кремнезема, цетеарилметикон, ксантановая камедь *, гиалуронат натрия **, ароматизатор (парфюм), каприлгидроксамовая кислота, глицерилкаприлат.[+/- (может содержать / peut contenir) слюда **, диоксид титана (CI 77891) **, оксид олова (CI 77861)]
* ИЗ ОВОЩЕЙ (D’ORIGINE VÉGÉTALE) ** НАТУРАЛЬНОЕ (D’ORIGINE NATURELLE) )

Poids Net Wt. 15 мл / 0,50 унций.

100% сертифицированный PETA продукт без жестокого обращения и веганский продукт (мы НЕ тестируем наши продукты или ингредиенты на животных)

ВЕГАН. БЕЗ ГМО. БЕЗ ГЛЮТЕНА

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Перегородчатые структуры апикальной мембраны между гепатоцитами необходимы для анизотропного расширения просвета и морфогенеза ткани печени.

Резюме

Полярность клеток является ключом к организации эпителия. В то время как поляризованные эпителиальные клетки имеют одну апико-базальную ось, гепатоциты проявляют сложную многоосевую полярность. Во время развития апикальные поверхности гепатоцитов анизотропно удлиняются, создавая трехмерную канальцевую сеть желчных канальцев (BC).Здесь, чтобы выяснить механизмы полярности гепатоцитов и преобразовать ее в простую эпителиальную полярность, мы оптимизировали систему культивирования первичных гепатобластов мыши, которая воспроизводит дифференцировку гепатоцитов и морфогенез BC. Примечательно, что мы обнаружили паттерн специфических расширений апикальной мембраны, запечатанных плотными соединениями, пересекающими просвет между двумя соседними гепатоцитами, которые напоминают переборки лодок. Эти апикальные переборки наблюдались также в развивающейся печени.Скрининг молекулярных факторов, необходимых для полярности гепатоцитов, показал, что молчание Rab35 вызывает потерю переборок, преобразование в простую полярность, образование цистоподобных структур и изменение судьбы клеток. Используя истощение Rab35 в развивающейся печени, мы можем реконструировать полярность гепатоцитов и запустить формирование эпителиальных трубок. Наши результаты предполагают новую модель морфогенеза РМЖ, основанную на механической стабилизации просвета канальцев.

Введение

Эпителиальные трубки являются важными компонентами нескольких органов, таких как почки и кишечник.Они состоят из клеток, которые проявляют апико-базальную полярность, причем апикальная поверхность обращена к внутреннему просвету , а базальная поверхность контактирует с базальной мембраной (Andrew and Ewald, 2010; Bryant and Mostov, 2008). Печень содержит два типа эпителиальных клеток, клетки желчных протоков (холангиоциты) и гепатоциты, оба происходят из эмбриональных предшественников, называемых гепатобластами (Müsch, 2018). Клетки желчных протоков представляют собой кубовидные или столбчатые эпителиальные клетки с типичной апико-базальной полярностью и апикальными поверхностями, имеющими общий просвет (Boyer, 2013; Treyer & Müsch, 2013).Гепатоциты, наиболее многочисленные эпителиальные клетки паренхимы печени, обладают особой полярностью, которую нельзя описать, используя только одну апико-базальную ось, как в простом эпителии (Treyer & Müsch, 2013). Гепатоциты многополярны с биаксиальной полярностью, характеризующейся двумя нематическими осями (Morales-Navarrete et al., 2019). In vivo , каждый гепатоцит обращен к синусоидальному эндотелию через несколько базальных доменов и может инициировать апикальный просвет с несколькими соседними гепатоцитами.В развивающейся печени просвет гепатоцитов анизотропно удлинен в виде трубчатого пояса, окружающего клетки, пересекая контактные мембраны между двумя соседними гепатоцитами (латеральный домен). Просвет в конечном итоге соединяется между собой, создавая сложную трехмерную просветную сеть из сильно разветвленных желчных каналов (BC) толщиной ~ 1 мкм (Morales-Navarrete et al., 2015). Функция BC — транспортировать желчь, секретируемую с апикальной поверхности гепатоцитов, к желчным протокам. Поток желчи через БК поддерживается осмотическим давлением, но также значительным вкладом актомиозин-зависимой сократимости (Meyer et al., 2017; Watanabe et al., 1991). Однако тот факт, что такая сократимость не вызывает перистальтических движений, вызывает недоумение и требует механистического объяснения.

Организация и функция ткани печени, таким образом, зависят от генерации простой эпителиальной полярности по сравнению с полярностью гепатоцитов и их результирующей морфологией просвета, механизмы которой до конца не изучены (Gissen and Arias, 2015; Müsch, 2014, 2018; Ober and Lemaigre, 2018 ; Танимидзу, Митака, 2017). В культурах 3D in vitro клетки желчных протоков образуют сферические кисты с полым просветом, аналогичные хорошо изученной клеточной системе MDCK (O’Brien et al., 2002; Tanimizu et al., 2007). С другой стороны, гепатоциты могут поляризоваться и образовывать BC-подобные структуры in vitro (Fu et al., 2010; Zeigerer et al., 2017). Интересно, что сверхэкспрессия Par1b в клетках MDCK изменяет ориентацию веретена и приводит к реорганизации просвета так, что они напоминают таковые у гепатоцитов. Напротив, подавление Par1b в клеточных линиях гепатоцитов (HepG2 и WIF9B) переориентирует микротрубочки, как в эпителиальных клетках, что приводит к простой апико-базальной полярности (Cohen et al., 2004b, 2004a; Лазаро-Диегес и др., 2013; Slim et al., 2013). Однако эти исследования проводились на клеточных линиях гепатоцитов, которые не повторяют специфическую морфологию удлиненных канальцев BC, а скорее образуют латеральный сферический просвет (Cohen et al., 2004b; de Marco et al., 2002). Механизмы, лежащие в основе морфогенеза удлиненной и разветвленной морфологии BC, все еще остаются неясными (Fu et al., 2010, 2011; Li et al., 2016).

На раннем этапе развития (E13-14 у мышей и крыс) кластеры гепатоцитов генерируют небольшие отдельные сферические просветы, которые в конечном итоге соединяются в непрерывную сеть, одновременно с выходом гемопоэтических предшественников из печени (E17-21) (Ober and Lemaigre, 2018; Tanimizu, Mitaka, 2016; Treyer, Müsch, 2013).Основываясь на исследованиях in vitro и с использованием клеточных линий гепатоцитов или первичных гепатоцитов, Tanimizu и Mitaka (2017) обосновали модель, в которой деление клеток является ключевым фактором удлинения апикального просвета. Согласно этой модели, активно пролиферирующие гепатоциты плода изменяют способ деления клеток. На первом этапе гепатоциты делятся асимметрично и образуют разные просветы с соседними гепатоцитами (Overeem et al., 2015). Если деление клеток симметрично, например при истощении Par1b клетки разделяют один и тот же просвет, образуя кисту (Slim et al., 2013). На втором этапе гепатоциты ориентируют свое веретено перпендикулярно оси просвета и подвергаются неполному делению, которое предотвращает разделение просвета между двумя дочерними клетками, что приводит к удлинению первоначального сферического просвета в типичный каналец BC (Tanimizu and Mitaka, 2017; Wang et al. др., 2014). Однако в развивающейся печени по мере того, как гепатобласты дифференцируются в гепатоциты, они постепенно прекращают пролиферировать, уменьшаясь с 25% деления на E14.5 до большей части покоя на E17.5 (Yang et al., 2017). Тем не менее, между E14.5 и E17.5 небольшой изолированный апикальный просвет расширяется и генерирует почти полностью связанную сеть BC (Tanimizu et al., 2016; см. Ниже рис. 7C). Это означает, что фетальным гепатоцитам требуются дополнительные механизмы, независимые от клеточного деления, для удлинения РМЖ, которые не могут быть захвачены клеточными линиями или модельными системами зрелых гепатоцитов.

Мы можем представить себе модель, в которой просвет удлиняется за счет анизотропного натяжения апикальной плазматической мембраны. Трубчатые структуры в других системах, таких как, например, трахеальная трубка Drosophila, обладают периодическим надклеточным паттерном актина (Hannezo et al., 2015; Hayashi and Dong, 2017), которые могут помочь стабилизировать просвет гепатоцитов по мере их удлинения и предотвратить изотропное расширение. На сегодняшний день мало что известно о генерации и удлинении апикального просвета гепатоцитов (Li et al., 2016; Müsch, 2018; Ober and Lemaigre, 2018; Tanimizu and Mitaka, 2017).

В этом исследовании мы использовали культуры первичных гепатобластов мыши, чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе анизотропного расширения апикального просвета для образования РМЖ. Нам удалось реорганизовать полярность гепатоцитов и преобразовать ее в полярность простых эпителиальных клеток, создав эпителиальные трубки вместо БК в развивающейся эмбриональной печени.

Результаты

Морфогенез просвета в гепатоцитах сопровождается специфическими актиновыми структурами, которые соединяют две просветообразующие клетки

Чтобы понять, как поляризуются гепатоциты с образованием апикального просвета трубчатой ​​формы, мы использовали хорошо зарекомендовавшую себя культуру первичных мышей. гепатобласты, выделенные из эмбриональной печени на основе экспрессии Dlk (Tanimizu et al., 2003), но оптимизированные условия (методы), чтобы дифференцировать их в гепатоциты и генерировать BC in vitro (Рисунок 1A).Гепатобласты образовали удлиненные и разветвленные трубчатые просветы, обогащенные F-актином и положительные по апикальному маркеру CD13 и белку плотных контактов ZO-1 (рис. 1В). Таким образом, эта система воспроизводит образование разветвленного BC-lumina in vitro , подобное развивающейся печени in vivo . Дифференциация гепатоцитов была подтверждена профилированием экспрессии генов. Мы использовали RNA-seq для сравнения изолированных гепатобластов, in vitro, дифференцированных гепатоцитов и зрелых гепатоцитов, выделенных из печени взрослых в качестве контроля. In vitro дифференцированные гепатоциты подавляли маркер гепатобласта Dlk и повышали экспрессию генов в зрелых гепатоцитах, например метаболические гены, такие как Tat, G6pc, Pck1, Cyp3a11 (рисунок 1C).

A) Схематический обзор первичных Dlk + гепатобластов в сэндвич-культуре Matrigel, дифференцирующихся в гепатоциты и воспроизводящих образование BC .

B) Дифференцированные гепатоциты образуют разветвленные взаимосвязанные просветы BC. Изображения иммунофлуоресцентной микроскопии дифференцированных гепатоцитов, окрашенных на F-актин с помощью Phalloidin-Alexa488 и на апикальные маркеры CD13 и ZO-1. Шкала шкалы: 10 мкм.

C) In vitro дифференцированные гепатоциты экспрессируют маркеры зрелых гепатоцитов и подавляют маркер гепатобласта Dlk. Тепловая карта, сравнивающая экспрессию выбранных маркерных генов гепатоцитов в первичных Dlk + гепатобластах (гепатобластах), in vitro, дифференцированных гепатоцитах (Diff.гепатоциты) и контрольные зрелые гепатоциты, выделенные из печени взрослых мышей (зрелые гепатоциты). Эксперимент RNA-seq в 4 биологических повторностях.

D) Изображения с покадровой микроскопии живых клеток, документирующие образование BC между двумя дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP. Во время визуализации расширяющийся трубчатый просвет показал выпуклость через 27 часов от начала визуализации, которая впоследствии была «повторно поглощена». На вставке D ’ показаны отдельные кадры, снятые каждые 10 минут с этого момента времени, документирующие восстановление канальца (белая звездочка).Обратите внимание на поперечный полосатый рисунок в каналах светлого поля и актина, который очевиден, когда просвет трубчатый, но не наблюдается внутри выпуклости. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок 1D (шкала: 10 мкм).

E) Изображение с помощью микроскопии локализации одной молекулы (SMLM) просвета между двумя дифференцированными гепатоцитами, актином, меченным Phalloidin-Alexa647. Обратите внимание на поперечный полосатый рисунок актина. Шкала шкалы: 5 мкм.

Для изучения морфогенеза просвета мы выполнили покадровую микроскопию живых клеток дифференцирующихся гепатобластов, стабильно экспрессирующих LifeAct-EGFP в качестве актиновой метки.Мы проследили люменогенез в течение 52 часов с 10-минутными интервалами и разделили четыре последовательных этапа:

1) начало просвета, 2) удлинение, 3) ветвление и 4) слияние. Мы часто наблюдали одиночные клетки, инициирующие несколько отдельных просветов со своими соседями (рисунок S1A, видео рисунок S1A). Интересно, что такая множественность просветов образовывалась независимо от деления клеток. Это обычное явление, потому что делящиеся клетки наблюдались редко. После образования просвет удлинился в трубки, пока они не охватили весь межклеточный контакт (Figure 1D, S1A, S1B, S1C, Videos Figure 1D, S1A, S1B, S1C).На этом этапе просвет может сливаться с другим просветом (Рисунок S1B, панели слева), разветвляясь на трехэлементном контакте (Рисунок S1B, панели справа).

Удлинение просвета в отсутствие деления клеток предполагает наличие анизотропных сил. Интересно, что мы также наблюдали случаи, когда просвет временно приобретал округлую форму (Рисунок 1D, Рисунок S1C, Видео Рисунок 1D, S1C), но эти структуры не расширялись изотропно, чтобы сформировать сферический просвет. Впоследствии они были «скорректированы», что свидетельствует о существовании механизмов контроля, которые активно усиливают анизотропию для предотвращения образования кистоподобных структур, типичных для эпителиальных клеток (Bryant, Mostov, 2008).

Нас заинтриговало присутствие темных полос в светлом поле, поперечном направлению удлинения просвета (например, рис. 1D, S1), что может соответствовать высокой кривизне апикальных мембран. Полосы также совпадали с областями высокой плотности актина (LifeAct-EGFP) и создавали впечатление, что они происходят в основном из одной клетки. Ниже мы увидим, что эта асимметрия полос наиболее вероятна из-за несовпадения ориентации фокальной плоскости и извитых межклеточных контактов. Этот узор был очевиден на ранних этапах формирования просвета и продолжался по мере удлинения просвета, сохраняя характерный интервал между полосами (рис. 1D, S1).Интересно, что когда просвет выпирал наружу, например, на Рисунке 1D ’(отмечен звездочкой), стремясь к сферическому просвету, это совпало с потерей полос. Впоследствии трубчатая форма просвета восстановилась после образования дополнительных полос, что свидетельствует об активной связи между полосатым рисунком и анизотропией удлинения просвета.

Чтобы определить микроструктуру богатых актином полосок, мы проанализировали кортикальный F-актин, меченный Phalloidin-Alexa-647, с помощью микроскопии локализации одной молекулы (SMLM) на фиксированных, in vitro и дифференцированных гепатоцитах.Поразительно, что мы наблюдали квази -периодический паттерн структур F-actin, по-видимому, пересекающих просвет между двумя клетками (Figure 1E). Поскольку SMLM имеет z-разрешение ~ 500 нм и эти структуры имеют высоту> 1 мкм, мы можем сделать вывод, что F-актин проецируется в просвет BC и не соответствует кольцам вокруг него, как в трахеальной трубке Drosophila. (Hannezo et al., 2015; Hayashi, Dong, 2017).

Ультраструктурный анализ выявляет переборку поперечных структур в просвете BC, физически соединяющих апикальные поверхности соседних клеток

Учитывая наличие как актиновых филаментов, так и плотных контактов (ZO-1), пересекающих просвет, мы исследовали структура апикальных поверхностей соседних клеток более подробно с помощью электронной микроскопии (ЭМ) на серийных срезах и трехмерных реконструкциях всего объема просвета.Примечательно, что ЭМ-сечение на рис. 2А показывает разветвленный просвет между тремя гепатоцитами с характерными гранулами гликогена, поверхности которых соединены пальцеобразными мембранными отростками. Пальцы одной клетки касаются или инвагинируют в противоположную клетку (рис. 2В), а контактные поверхности герметизируются плотными соединениями (рис. 2С, D). Интересно, что мы наблюдали, что везикулы часто накапливались в основе этих отростков.

A) Электронно-микроскопическое изображение BC, разветвленного между тремя клетками.Продольный срез in vitro дифференцированных гепатоцитов. GG: гранулы гликогена. Обведенная область показана на панели B. Масштабная шкала: 5 мкм.

B) Сечение BC, образованное двумя ячейками из серии продольных сечений 90 нм, показанных на Bi-Biv. Выделенные области с поперечными мембранными соединениями показаны на панели C и D . Мембранные соединения видны не на каждой секции (Bi-Biv) . Шкала шкалы: 1 мкм.

C) и D) Детальный вид выделенных областей на панели B . Мембранные соединения образованы апикальными поверхностями обеих ячеек, выстилающих BC, и включают плотные соединения (TJ, стрелки). Везикулы (V) часто накапливаются в непосредственной близости от соединений. Шкала шкалы: 1 мкм.

E) Трехмерная реконструкция серийных срезов в B (Bi-Biv) на основе апикальных плазматических мембран и визуализации плотных контактов. Цитоплазма просветообразующих клеток зеленого и синего цвета, плотные контакты выделены красным.См. Также Прил. Видео S1.

F) Упрощенная модель БК на основе трехмерной реконструкции в E с периодическими переборками мембранных соединений, образованных сверху или снизу просвета (стрелки). Плотные соединения (красные) имеют Т-образную форму, причем соединения расположены продольно вдоль трубы, соединенные с соединениями, проходящими вдоль линии гребня внутри каждой переборки. Непрерывный поток в просвете между переборками показан пунктирной линией. См. Также видео на рис. 2F.

По одному сечению невозможно установить, является ли просвет непрерывным или разделен на отдельные камеры. Трехмерная реконструкция (Рисунок 2E, Видео Рисунок 2F, Дополнение Видео S1) показала, что поперечные пальцевидные отростки (Рисунок 2A) были сечениями структур, напоминающих переборки лодки. Переборки состояли из двух частей, каждая из которых составляла апикальную поверхность одной из двух соседних ячеек, которые образовывали гребневидный отросток (см. 3D-модель, рис. 2F, видео, рис. 2F, доп.Видео S1). Важно отметить, что два выступа были герметизированы плотными соединениями, имевшими необычную Т-образную форму, причем горизонтальная полоса представляла соединения, продольные вдоль трубы, а вертикальная полоса — соединения, проходящие вдоль линии гребня (см. Схему на Рисунке 2E, Видео Рисунок 2F, Дополнение видео S1). Данные ЭМ согласуются с наличием структур ZO-1 в полосах, пересекающих просвет (рис. 1B). В некоторых случаях противостоящие отростки не выровнены точно по линии гребня, а смещены, образуя широкий контактный пояс с плотным стыком (рис. 2B, 2E, переборки B1, 4).Переборки могут выходить либо снизу (рис. 2F, переборка B3), либо сверху (рис. 2B, 2E, переборки B1, 2, 4), но никогда не пересекают ее полностью, что обеспечивает непрерывность просвета в BC (видео Рисунок 2F, Дополнительное видео S1). Следовательно, из трехмерной реконструкции на Рисунке 2B и Приложении. Видео S1 видно, что просвет имеет извилистую форму. Этим объясняется впечатление, что флуоресцентные и светлопольные полосы F-актина лишь частично пересекают просвет (Рис. 1D). квази -периодичность переборок, следовательно, может объяснить паттерн актина, наблюдаемый при визуализации живых клеток (Рис. 1D) и SMLM (Рис. 1E).

В целом, ЭМ-анализ показал, что соседние гепатоциты физически связаны не только вдоль пояса плотных контактов, но и внутри просвета через повторяющиеся поперечные связи между апикальными поверхностями, герметизированными плотными контактами. Эти апикальные структуры, следовательно, могут объяснять высокую плотность F-актина, визуализированную с помощью световой микроскопии (Рис. 1C-E).

Поперечные апикальные мембранные структуры формируются во время морфогенеза просвета BC в эмбриональной печени

Повторяющийся узор переборок поперечных соединений может быть характерной чертой системы культивирования in vitro , где клетки прикрепляются к одной и той же поверхности и вынуждены для формирования 2D-слоев. Чтобы убедиться, что такая организация имеет физиологическое значение, мы исследовали ультраструктуру зарождающегося BC в эмбриональной печени. Также здесь ЭМ на серийных срезах (рис. 3A, B) и трехмерная реконструкция просвета BC (рис. 3C, D) в эмбриональном состоянии (E15.5) печень подтвердила наличие переборки поперечных соединений. Форма просвета была даже более сложной, чем у in vitro , из-за трехмерной организации ткани с более высокой степенью свободы для межклеточных контактов. Важно отметить, что также in vivo переборки не разделяли просвет BC на изолированные камеры (рис. 3C, D). Эти результаты подтверждают структурную организацию гепатоцитов, наблюдаемых in vitro , и подтверждают вывод о том, что две противоположные апикальные поверхности физически связаны поперечными связями.

A) и B) Изображения электронной микроскопии двух последовательных срезов формирующегося BC в печени E15.5, окруженных плотными соединениями (белые стрелки). Просвет двух соседних гепатоцитов обведен белым. Черные стрелки указывают на плотные стыки внутри мембранных перемычек B1 и B2. Масштабная шкала: 500 нм.

C) и D) 3D модель просвета A.и B., основанный на визуализации поверхности просвета на серийных срезах. В левой нижней части (пунктирная черная линия) продолжается ВС. Белыми стрелками обозначены переборки B1, B2, показанные на A. и B. соответственно. Масштабная шкала: 500 нм.

Преобразование полярности гепатоцитов в простую апико-базальную полярность

Формирование апикальных отростков в виде перемычки in vitro и in vivo может быть специфической особенностью канальцевого просвета гепатоцитов, поскольку они никогда не описывались простыми словами. эпителий, включая цисты in vitro .В развивающейся печени гепатобласты могут давать начало гепатоцитам, генерирующим РМЖ, или клеткам желчных протоков, формирующим канальцевый эпителий. При культивировании in vitro клетки желчных протоков образуют трехмерные кисты со сферическим просветом (Huch et al., 2013; Prior et al., 2019; Tanimizu et al., 2007). Наша цель состояла в том, чтобы использовать первичные гепатобласты для преобразования одного типа клеточной полярности в другой. С этой целью мы создали систему in vitro , которая может воспроизводить как гепатоциты, так и простую апико-базальную полярность одновременно, бок о бок в одной и той же культуре.Чтобы нейтрализовать эффект ЕСМ (Tanimizu et al., 2004, 2007) и сосредоточить внимание на внутренних клеточных факторах, регулирующих форму просвета, мы использовали первичные гепатобласты в тех же условиях культивирования. Путем оптимизации условий культивирования (см. Методы) гепатобласты, которые дифференцировались в гепатоциты, образовали разветвленные BC-подобные структуры на дне лунки (рис. 4A), тогда как клетки желчных протоков (Sox9-положительные) образовали трехмерные кисты, которые поднимались из дно в среду (рис. 4A ‘, A’ ‘).

A) Проверка системы культивирования.Смесь первичных гепатобластов и клеток желчных протоков образует BC и цисты в одних и тех же условиях культивирования. Изображения в различных z-положениях демонстрируют, что цисты растут в z-направлении (A ’, A’ ’), в то время как гепатоциты с BC образуют клеточный слой вблизи дна лунки. Клетки окрашивали на F-актин с помощью Phalloidin-Alexa488. Шкала шкалы: 10 мкм. Схемы представляют вид XZ.

B) Нокдаун Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах вызывал образование цистоподобных структур (B ’), тогда как клетки, обработанные контрольной siRNA (siLuc), не были затронуты и образовали BC.Микроскопические изображения клеток, окрашенных на F-актин с помощью Phalloidin-Alexa488. Шкала шкалы: 30 мкм. См. Также видео рисунок 4B ’(шкала: 30 мкм).

C) 3D-реконструкция клеток, обработанных миРНК Rab35, демонстрирует вариабельность фенотипа от увеличенного набухшего просвета до сферических кистоподобных структур, растущих в z-направлении (просвет окрашен апикальным маркером CD13). БК, соединенный с кистой, напоминает организацию перипортальной зоны в ткани печени.

D) Три независимых дуплекса миРНК Rab35 подавляют уровни белка Rab35 на 73% ± 3% (n = 3, планка погрешностей: стандартное отклонение).Репрезентативный вестерн-блоттинг и количественная оценка нокдауна белка.

E) Микроскопические изображения дифференцированных гепатоцитов, обработанных люциферазой или миРНК Rab35, окрашенных антителами Rab35 (желтый). Rab35 локализуется в апикальной и латеральной плазматической мембране и цитоплазматической точке. Уровни Rab35 заметно снижаются в кистоподобных структурах, образованных при трансфекции siРНК Rab35.

F) Локализация экзогенного EGFP-Rab35 в поляризующих гепатобластах.Шкала шкалы: 10 мкм.

G) Гистограмма локального радиуса просвета в контрольных клетках и клетках, обработанных миРНК Rab35, оцененная на основе анализа изображений под микроскопом. Нокдаун Rab35 тремя независимыми миРНК приводит к смещению в сторону просвета с большим радиусом (n = 3 (с 4 изображениями на условие), планки ошибок: SEM).

H) Фенотип увеличенного просвета в клетках, обработанных миРНК Rab35, восстанавливается за счет экспрессии человеческого Rab35-EGFP из рекомбинантного аденовируса.Частотная кривая радиуса просвета (желтый) перекрывается с одной из контрольных клеток, экспрессирующих только EGFP. Сам по себе EGFP не влияет на увеличение просвета, вызванное нокдауном Rab35 (красный). (n = 3 (с 4 изображениями на условие), планки ошибок: SEM).

Достигнув системы in vitro , которая воспроизводит два типа клеточной полярности и морфологии просвета, мы приступили к идентификации генов, необходимых для этих процессов, с использованием подхода РНКи. На сегодняшний день только несколько генов связаны с регуляцией морфологии просвета гепатоцитов ( Mark2 / Par1b, Pard3, Stk11 / Lkb1, Cdc42 ) в клеточных линиях гепатоцитов или первичных гепатоцитах (Cohen et al., 2004b; Fu et al., 2010; Wang et al., 2014; Юань и др., 2009). Мы провели целенаправленный скрининг 25 генов-кандидатов, включая вышеупомянутые, кодирующие ключевые регуляторные компоненты полярности клеток (Таблица S1): формирование апикального соединения (например, Pard3, Tjp1, Cldn2), регуляция цитоскелета (например, Mark2 / Par1b, Stk11 / Lkb1). , Cdc42) и поляризованный трафик (например, Rab11a, Rab35, Cdc42). Для скрининга мы разработали независимые дуплексы миРНК с использованием специализированного программного обеспечения, отобрали шесть миРНК с наивысшей оценкой функциональности на каждый ген-мишень и синтезировали их с модификациями для повышения их стабильности (Farzan et al., 2017; Reynolds et al., 2004). Клетки трансфицировали миРНК и через 5 дней в культуре окрашивали на F-актин, который обогащен в апикальном домене (рис. 1C, D, 4A). Хит-кандидатами были те, которые давали фенотип проникающего просвета как минимум с двумя миРНК. Подавление Ocln (рисунок S4A) и Tjp1 (рисунок S4B) привело к потере полярности с де-локализацией F-актина и уменьшением интенсивности апикального маркера CD13 из-за отсутствия просвета. Примечательно, что из 25 проверенных генов молчание Cdc42 и Rab35 не повлияло на полярность клеток, судя по локализации CD13 и ZO-1, но изменило морфологию просвета (рис. S4C, 4B, S4D).Молчание Cdc42 вызывает расширение сферического просвета (Figure S4D, Table S1), таким образом воспроизводя фенотип, описанный у печеночно-специфичных мышей Cdc42 KO (Yuan et al., 2009), и подтверждая наш подход. Однако нокдаун Rab35 дал наиболее яркий фенотип, что привело к образованию крупных кистоподобных структур (фиг. 4B, S4D и видео-фиг. 4B ’) вместо BC, как в контроле (Люцифераза, siLuc). Оптическое сечение и трехмерная реконструкция показали, что просвет этих кист был связан с БК, образованным соседними гепатоцитами (рис. 4С), что указывает на то, что клетки действительно отображали два типа полярности бок о бок, напоминая организацию перистальтики. портальная зона ткани печени (Antoniou et al., 2009; Мюш, 2018; Обер и Лемегр, 2018). Rab35 — это универсальная малая ГТФаза, участвующая во многих клеточных процессах, связанных с полярностью клеток и образованием просвета (Klinkert and Echard, 2016). Учитывая силу фенотипа и поскольку Rab35 ранее не имел связи с морфологией просвета гепатоцитов, мы решили сосредоточиться на этом гене и изучить его функцию более подробно.

Rab35 лимитирует скорость образования просвета гепатоцитов

Для начала мы подтвердили специфичность фенотипа Rab35 РНКи.Во-первых, из шести разработанных миРНК пять давали подавление мРНК Rab35 более чем на 50% через 96 часов и демонстрировали различную степень изменения просвета. Три миРНК (siRab35 # 2, # 4, # 5), которые последовательно давали самый сильный фенотип, снижали мРНК Rab35 (рисунок S4F) и уровень белка более чем на 70% (рисунок 4D). Во-вторых, Rab35 был обогащен апикальной поверхностью гепатоцитов, а также латеральной плазматической мембраной и цитоплазматическими пузырьками (рис. 4E), что согласуется с описанной эндосомной локализацией (Klinkert et al., 2016; Куранти и др., 2006). После замалчивания это окрашивание заметно уменьшилось (рис. 4E). В-третьих, экспрессия экзогенного EGFP-меченного Rab35 дала аналогичный образец локализации (рис. 4F). Интересно, что Rab35 не только обогащен апикально, но также присутствует на поперечных связях, которые динамически ремоделируются, поскольку апикальный просвет анизотропно расширяется (Рис. 4F). В-четвертых, чтобы дополнительно подтвердить, что потеря Rab35 является специфической причиной наблюдаемого фенотипа, мы провели эксперимент по спасению, в котором мы восстановили экспрессию Rab35 посредством вирусной трансдукции человеческого Rab35, устойчивого к siRab35 # 4.Мы количественно оценили эффект нокдауна Rab35 на морфологию просвета, измерив радиус отдельного просвета в контрольных и нокдаунных условиях и построив график частотного распределения значений. Три дуплекса миРНК, нацеленные на мРНК Rab35, наблюдали постоянный сдвиг в сторону большего просвета в условиях нокдауна (рис. 4G). Важно, что в контрольных условиях мы едва могли наблюдать просвет с радиусом более 6 мкм, тогда как после подавления Rab35 ~ 20-25% просвета имели радиус> 6 мкм.Опосредованная аденовирусом экспрессия EGFP-меченного Rab35 была способна спасти фенотип подавления Rab35, сдвигая распределение радиуса просвета в сторону контроля, тогда как экспрессия EGFP не влияла (фиг. 4H). В целом, эти результаты подтверждают, что Rab35 лимитирует скорость генерации просвета BC гепатоцитов и его истощение вызывает образование кистоподобных структур, подобных тем, которые формируются клетками желчных протоков in vitro .

Молчание Rab35 вызывает потерю поперечных апикальных переборок и образование сферических кист за счет процесса самоорганизации клеток

Чтобы понять механизм истощения Rab35 в морфогенезе просвета, мы визуализировали экспрессирующие LifeAct-EGFP клетки, трансфицированные Rab35 или Люцифераза siRNA в качестве контроля с помощью покадровой микроскопии живых клеток, как описано выше (Рисунок 1D, Рисунок S1).В то время как нормальные и контрольные дифференцирующиеся гепатобласты, трансфицированные siRNA люциферазы, образовывали удлиненный просвет, после трансфекции siRNA Rab35 они генерировали сферический просвет, первоначально между двумя клетками (фиг. 5A, видео-фиг. 5A). Со временем мы могли наблюдать основные перестройки клеток, в результате которых клетки перемещались и меняли форму своей апикальной поверхности, что приводило к слиянию просвета и формированию трехмерных многоклеточных кист (Рисунок 5B, видео Рисунок 5B), как показано на рисунке 4C. Также в этом случае такая реорганизация не была результатом деления клеток, как для других цист, образованных in vitro (Jewett and Prekeris, 2018), а скорее в результате процесса самоорганизации.Сферическое расширение просвета происходило только в тех случаях, когда клетки не могли сформировать полосатый актиновый паттерн, указывающий на переборки, обычно присутствующие в просвете BC (фиг. 5A, B, видео, фиг. 5A, 5B). Напротив, удлиненный просвет, который все еще сформировался, всегда содержал поперечные полосы актина. Тщательный осмотр видео изображений живых клеток (например, видео рис. 1D, 5B) показал, что исчезновение поперечных переборок предшествует формированию сферического просвета.

A) В клетках, обработанных миРНК Rab35, просвет имеет тенденцию расти в виде сфер, а не удлиненные, как трубочки.Изображения из эксперимента с покадровой микроскопией живых клеток, показывающие два соседних дифференцирующихся гепатобласта, экспрессирующих LifeAct-EGFP в условиях siRNA Rab35. Белая звезда указывает на формирующийся просвет между двумя ячейками. Обратите внимание, что типичный поперечный полосатый паттерн актина, наблюдаемый в трубчатом BC, отсутствует. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок 5A (шкала: 10 мкм).

B) Многоклеточные кистоподобные структуры образуются в результате перегруппировки клеток. Изображения из эксперимента по покадровой микроскопии живых клеток.Клетки самоорганизуются таким образом, что три отдельных просвета (черная звезда) в конечном итоге сливаются в один большой сферический просвет при отсутствии деления клеток. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок 5B (шкала: 10 мкм).

C) EM анализ кистообразного просвета, возникшего в результате нокдауна Rab35. Между пятью клетками образованы три последовательных продольных участка просвета по 90 нм. В просвете отсутствуют переборки, характерные для БК гепатоцитов. Стрелки указывают на плотные стыки.GG: гранулы гликогена. Шкала шкалы: 5 мкм.

D) Продольный вид через середину 3D-модели просвета, основанный на визуализации плазматических мембран и плотных контактов (красный) на серийных срезах. Пять клеток, образующих просвет, представлены разными цветами (голубым, фиолетовым, желтым, синим и зеленым). Красные стрелки указывают на плотные соединения, в которых киста разрезана, чтобы показать сагиттальный вид на (D).

E) Сагиттальный вид просвета. Просвет имеет круглый профиль, и плотные соединения не выступают в просвет.

Чтобы подтвердить потерю переборок в сферическом просвете, мы исследовали их ультраструктуру с помощью ЭМ на серийных срезах и трехмерной реконструкции всего объема просвета. Мы сосредоточились на большом кистообразном просвете, образованном несколькими клетками. Отдельные ЭМ-срезы кистообразного просвета между пятью клетками показали, что переборки, которые обычно присутствуют в просвете BC, отсутствуют (рис. 5C). Это было подтверждено трехмерной моделью просвета, основанной на визуализации плазматических мембран и плотных контактов (рис. 5D).Кроме того, плотные соединения между клетками не выступали в просвет, как видно на сагиттальном разрезе 3D-модели (рис. 5D).

Эти результаты подтверждают, что подавление Rab35 в дифференцировке гепатобластов вызывает потерю поперечных переборок и превращает просвет канальцев BC в кистоподобные структуры.

Подавление Rab35 влияет на дифференцировку гепатоцитов

Кистоподобные структуры, генерируемые на Rab35 KD дифференцировкой гепатобластов, напоминают кисты, образованные Sox9-положительными клетками первичного желчного протока in vitro (Рисунок 4A).Это поднимает вопрос о том, вызывает ли потеря Rab35, помимо модификации фенотипа клеточной полярности, изменение приверженности гепатобластов клеткам желчных протоков или, альтернативно, изменение судьбы клеток гепатоцитов. Чтобы ответить на этот вопрос, мы охарактеризовали профиль транскрипции клеток при молчании Rab35 с помощью анализа RNA-seq. Мы обнаружили 313 дифференциально транскрибируемых генов в клетках, трансфицированных миРНК Rab35 по сравнению с миРНК Luc в качестве контроля (логарифм _{2, отсечка изменения в} раз 0.5, пороговое значение p 0,01). Поразительно, что гены-маркеры зрелых гепатоцитов, например Serpina1, Ces1c, Pck1, Cyp3a11 подавлялись в клетках, трансфицированных siRab35 (фиг. 6A, отрицательное изменение Log _{2 в} раз, пурпурный), тогда как гены, связанные с апико-базальной полярностью в эпителиальных клетках, обычно не экспрессируются. в гепатоцитах, были активированы (Фигура 6A, положительное Log ₂ -кратное изменение, зеленый), например Ap1m2, Mal, Grhl2 и Rab25 (Fölsch et al., 1999; Ramnarayanan et al., 2007; Senga et al., 2012). Grhl2 был идентифицирован Senga et al. (2012) как фактор транскрипции, специфичный для клеток желчных протоков, утверждая, что клетки приобретают черты клеток желчных протоков. Этот вывод был подтвержден открытием, что маркеры клеток желчных протоков Tacstd2 ( Trop2 ) и Krt19 (Segal et al., 2019) также были активированы. Мы проверили экспрессию различных маркеров на уровне белка с помощью иммунофлуоресценции, особенно в клетках, образующих цисты в результате молчания Rab35 (рис. 6В).Некоторые клетки цист продолжали экспрессировать альбумин (хотя и на более низком уровне), сохраняли накопление гранул гликогена в цитоплазме и не имели ресничек (рис. 5C), что позволяет предположить, что эти гепатобласты дифференцировались в гепатоциты, а затем изменили судьбу клеток в сторону клетки желчных протоков. Однако другие клетки были Krt19 + / Alb- (обрисованы в общих чертах на Фигуре 6B), что указывает на активацию программы клеток желчных протоков в гепатобластах. Тем не менее, эти клетки не экспрессировали Sox9, ранний маркер клеток желчных протоков, необходимых для образования ресничек (Antoniou et al., 2009; Poncy et al., 2015), указывая на то, что они не приобретают полную судьбу клеток желчных протоков.

A) Вулканический график, показывающий повышенную и понижающую регуляцию генов при обработке siRNA Rab35 по сравнению с контрольной siRNA. Гены-маркеры для гепатоцитов подавляются (пурпурный, например, Serpina1e, Ces1c, Pck1, Cyp3a11 ), тогда как гены, как правило, не экспрессируются в гепатоцитах, но в других типах эпителиальных клеток регулируются вверх (зеленый, e.грамм. А p1m2, Grhl2, Rab25, Krt19 ).

B) Изображения иммунофлуоресцентной микроскопии кистоподобной структуры по сравнению с контрольными клетками. В кисте некоторые клетки положительны по Krt19 (белый контур) и почти не имеют экспрессии альбумина. В контроле практически не обнаруживается Krt19. Шкала шкалы: 10 мкм.

C) Графики обогащения из анализа обогащения набора генов (GSEA) для проверки того, обогащены ли дифференциально экспрессируемые гены в A профилями экспрессии генов гепатоцитов, гепатобластов или клеток желчных протоков.Гены с пониженной регуляцией (пурпурный) избыточно представлены в гепатоцитах, тогда как гены с повышенной регуляцией (зеленый цвет) обогащены профилем экспрессии генов клеток желчных протоков. P-значения указаны над кривой GSEA.

A) Иммунофлуоресцентные изображения ткани печени, полученные через 4 дня после in utero инъекции люциферазы (siLuc) и миРНК Rab35 (siRab35), сформированные в LNP через желточную вену в E13.5 эмбрионов. Квадрат на изображениях с низким увеличением (масштабная полоса: 500 мкм) показывает, где было снято изображение с высоким разрешением (масштабная полоса: 20 мкм). Изображаемые области расположены в паренхиме печени, лишенной маркера клеток желчных протоков Sox9. Вставки (масштабная линейка: 20 мкм) на панелях A ’ и A’ ’ показывают разницу между BC и просветом желчного протока в печени, инъецированной LNP-siRab35. Панель A ’’ ’ сравнивает просвет канальцев в паренхиме с просветом желчного протока в портальной области (Sox9-положительный результат).

B) Иммунофлуоресцентные изображения тканей печени из A показывают примеры полярности гепатоцитов в контрольной ткани (один гепатоцит образует несколько просветов на клетку) и простой апико-базальной полярности в печени, инъецированной LNP-siRab35 (клетки имеют единый апикальный домен, ориентированный на общий просвет).

C) и D) Трехмерная реконструкция просвета, меченного апикальным маркером CD13, в срезах ткани печени толщиной 100 мкм, инъецированных LNP-siLuc ( C ) и LNP-siRab35 ( D ).Шкала шкалы: 30 мкм. См. Также рисунок 7CD на видео.

E) Количественная оценка распределения радиуса просвета на основе трехмерных реконструкций, таких как C и D (n = 3, планки ошибок: SEM).

F) Трехмерная реконструкция канальца, обнаруженного в печени после инъекции LNP-siRab35, показывает просвет зеленого цвета, окруженный множеством клеток. См. Также видео на рис. 7F.

G) Количественное определение количества клеток, окружающих просвет, по отношению к радиусу просвета и положению вдоль канальца.

Чтобы понять, в какой степени молчание Rab35 изменяет дифференцировку клеток-предшественников гепатоцитов, мы сравнили транскриптом клеток, трансфицированных siRNA (контроль и siRNA Rab35, фиг. 6A) с транскриптомом трех типов клеток: гепатобластов, взрослых гепатоцитов и клеток желчных протоков. . С этой целью мы выполнили анализ обогащения набора генов (GSEA), широко используемый метод интерпретации данных экспрессии генов (Mootha et al., 2003; Subramanian et al., 2005). GSEA рассчитывает так называемую оценку обогащения, которая показывает, насколько сильно данный набор генов чрезмерно представлен среди генов с высоким рейтингом в списке.При построении оценки обогащения восходящая кривая в левой части графика указывает на чрезмерную представленность в верхней части ранжированного списка генов. В нашем анализе все три ранжированных списка были созданы с использованием DESeq2 (Love et al., 2014) и отражают сравнение профилей экспрессии генов между одним типом клеток и двумя другими. На первом этапе мы использовали GSEA для исследования чрезмерной представленности генов, подавляемых при подавлении Rab35 молчания в трех вышеупомянутых типах клеток. Полученные графики обогащения (верхний ряд на фиг. 6C) ясно показывают чрезмерную представленность исследуемого набора генов во взрослых гепатоцитах.В гепатобластах было обнаружено лишь небольшое избыточное количество, тогда как в клетках желчных протоков не наблюдалось никакого обогащения. Затем мы повторили анализ, используя набор генов, активируемых при замалчивании Rab35. Интересно, что полученные графики (нижний ряд рисунка 6C) показали чрезмерное представительство исследуемого набора генов в клетках желчных протоков, в то время как практически не было обнаружено никакого обогащения в двух других типах клеток. Это подтверждает положительную корреляцию профилей экспрессии генов между транскриптомами клеток, трансфицированных siRab35, и клеток желчных протоков.

Таким образом, результаты показывают, что подавление Rab35 изменяет профиль транскрипции гепатобластов, предполагая как изменение предопределенности клеток гепатоцитов по умолчанию ( in vitro, ) в отношении судьбы клеток желчных протоков, так и изменение судьбы клеток. через переход от дифференцированных гепатоцитов к клеткам желчных протоков. Такой переход не является однозначным, так как в некоторых клетках он более эффективен, чем в других, и ни одна из них не приобретает полную судьбу клетки желчного протока.

Реинжиниринг архитектуры ткани печени путем подавления Rab35

Специфическая полярность гепатоцитов является ключевым элементом для организации ткани печени, в частности, для формирования сети BC, которая очень отличается от других простых эпителиев. , в том числе желчный проток. Изменение полярности клеток, вызванное молчанием Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах in vitro , предоставляет средства для попытки реконструировать ткань печени путем модификации просвета BC и самоорганизации клеток in vivo .Следовательно, мы установили изменение полярности гепатоцитов путем подавления Rab35 в развивающейся печени in vivo . Полная потеря Rab35 в линии мышей KO является эмбрионально летальной (Dickinson et al., 2016), предположительно из-за дефектов цитокинеза (Kouranti et al., 2006). Чтобы обойти эту проблему и истощить Rab35 как in vitro , мы воспользовались липидными наночастицами (LNP), разработанными для терапии человека, что позволяет специфическую доставку миРНК к гепатоцитам в печени (Akinc et al., 2010; Zeigerer et al., 2012). Для нацеливания на эмбриональную печень E13.5 мы использовали метод in utero инъекции через желточную вену (Ahn et al., 2018). Сначала мы проверили методику на мышах, экспрессирующих GFP, нацеленную на мембрану. Мы выполнили инъекцию in utero siRNA LNP-GFP или люциферазы (в качестве контроля) в эмбрионы E13.5 и собрали печень через 4 дня развития (рисунок S7A). Сигнал GFP в печени был заметно и однородно снижен в гепатоцитах, тогда как разные типы клеток, например.грамм. гемопоэтические клетки не были затронуты (фигура S7B).

Затем мы сформулировали миРНК Rab35, подтвержденную in vitro (фиг. 4D, G, H), и миРНК люциферазы в LNP и вводили их в эмбриональную печень, как описано выше. Мы проанализировали влияние на ткань печени, используя последовательность иммуноокрашивания, визуализации глубоких тканей и трехмерной реконструкции (Morales-Navarrete et al., 2015) (рис. 7A). Как и в контрольной печени, в печени E17.5, инъецированной миРНК LNP-люциферазы, развивались нормальные удлиненные канальцы BC, образованные двумя соседними гепатоцитами (фигура 7A ’).Поразительно, что инъекция миРНК LNP-Rab35 индуцировала образование больших трубчатых структур в паренхиме печени (фигура 7A ’’). Поскольку эти структуры очень похожи на желчные протоки на этой стадии развития, нам нужно было исключить, что они могут быть образованы клетками желчных протоков. Во-первых, трубчатые структуры присутствуют по всей паренхиме и удалены от портальной области, где расположены желчные протоки. Во-вторых, окрашивание HNF4a и Sox9 подтвердило, что клетки, образующие канальцы, экспрессировали маркеры гепатоцитов и не были полностью дифференцированными клетками желчных протоков (рис. 7A ’’ ’Suppl.Рисунок S7C), аналогичный клеткам in vitro (Рисунок 5C, 6B). Важно отметить, что организация канальцев предполагает изменение полярности клеток. В то время как в контрольной ткани отдельные гепатоциты образовывали множественные просветы на клетку (характеристика полярности гепатоцитов), клетки, образующие большие трубчатые структуры, поляризованные с одной апико-базальной осью и имели общий апикальный просвет (Рисунок 7B, см. Ниже).

Чтобы продемонстрировать, что большие трубчатые структуры не изолированы, а являются частью взаимосвязанной просветной сети, мы выполнили трехмерную реконструкцию апикальных поверхностей (отмеченных CD13) на срезах толщиной 100 мкм (Рисунок 7B).В нормальной печени и печени, в которую была введена миРНК LNP-люциферазы, CD13 имел типичный вид трехмерной сети BC (рисунок 7C, видео рисунок 7CD). Напротив, в печени, инъецированной siRNA Rab35, трехмерная реконструкция выявила глубокие изменения морфологии просвета вблизи центральной вены, то есть на расстоянии от перипортального желчного протока (рис. 7D, видео-рисунок 7CD). Количественная оценка реконструированного просвета показала общее увеличение радиуса просвета (рис. 7E), подобное тому, которое наблюдалось для in vitro (рис. 4G).Примечательно, что 30 ± 11% просвета имели радиус просвета значительно больше, чем BC в контрольной печени. Трехмерная реконструкция сегментов больших трубчатых структур подтвердила, что трубки образованы множеством клеток, в среднем 4 клетки имеют один и тот же просвет (Рисунок 7F, G; Видео Рисунок 7F). Эти результаты предполагают, что нам удалось реорганизовать структуру ткани печени путем подавления Rab35 in vivo . Это привело к модификации клеточной полярности гепатоцитов, которые вместо того, чтобы формировать BC, самоорганизовались в канальцевые эпителиальные структуры, подобные желчным протокам.

Обсуждение

Механизмы, лежащие в основе специфической полярности гепатоцитов и образования РМЖ, плохо изучены, и были предложены различные модели, включая асимметричное деление клеток (Fu et al., 2011; Li et al., 2016; Müsch, 2018; Обер, Лемегре, 2018; Танимидзу, Митака, 2017). Однако в эмбриональной печени создается почти полностью связанная сеть BC, несмотря на постепенное прекращение пролиферации гепатобластов (Tanimizu et al., 2016; Yang et al., 2017, рисунок 7C).Более того, первичные зрелые гепатоциты в культуре могут образовывать канальцевую сеть BC без значительного клеточного деления (Fu et al., 2010). В этом исследовании мы искали механизм, который мог бы объяснить своеобразную трубчатую форму апикального просвета гепатоцитов. Мы обнаружили наличие очень специфических расширений апикальной мембраны, запечатанных плотными контактами в просвете между двумя соседними гепатоцитами, которые удовлетворяют критериям для обеспечения анизотропного удлинения формирующегося канальца BC. Лучшая аналогия, которую мы могли найти этим конструкциям, — это переборки лодок, кораблей и самолетов.Переборки обеспечивают конструктивную устойчивость и жесткость, укрепляя структуру сосудов удлиненной формы. Здесь апикальные переборки являются квази -периодическими и могут обеспечивать механическое соединение между апикальными поверхностями гепатоцитов, которые остаются «слипшимися» вместе по мере роста просвета. В их отсутствие (при подавлении Rab35) апикальные поверхности гепатоцитов теряют свой анизотропный рост, и просвет превращается из удлиненного в сферический, что типично для простых эпителиальных клеток. Таким образом, наши данные предполагают, что механическое соединение между гепатоцитами лежит в основе образования РМЖ и дает беспрецедентное понимание давней проблемы эпителиального морфогенеза паренхимы печени.

В нашей установке культуры первичные гепатобласты дифференцируются в гепатоциты и повторяют образование BC без деления клеток, что подтверждается экспериментами по визуализации живых клеток. Первоначально гепатоциты образуют просвет между дублетами клеток. Просветы закрыты и не имеют выхода для слива внутренней жидкости. Следовательно, увеличение осмотического давления в результате прокачки осмолитов через апикальную мембрану должно приводить к образованию сферического просвета, а не трубчатого. Из физики тонких оболочек образование трубчатого просвета с внутренним давлением и без выходов требует анизотропии поверхностного натяжения и / или жесткости стенки (Berthoumieux et al., 2014; Ландау, Лифшиц, 1986). Перегородки являются конструктивными элементами, которые могут обеспечить такую ​​анизотропию и механическую стабильность удлиненного просвета под внутренним давлением. Положение переборок может быть определено с помощью механо-сенсорных механизмов, связанных с натяжением и локальной кривизной через актиновую кортикальную сетку (Meyer et al., 2020). Переборки были обнаружены в эмбриональной печени, что позволяет предположить, что они не являются артефактом клеточной культуры, но имеют физиологическое значение. Удлинение апикального просвета влечет за собой также перемещение и перегруппировку межклеточных контактов, что сопровождается образованием новых переборок (Рис. 1D, S1C).Соответственно, при отсутствии переборок просветы растут изотропно, образуя цисты вместо рядов гепатоцитов (рис. 5A и 5B).

Обнаружение апикальных переборок гепатоцитов привлекает внимание к механизму, лежащему в основе их образования. Мы получили несколько сигналов из морфологического анализа и функционального скрининга с помощью РНКи. Во-первых, переборки характеризуются Т-образным расположением плотных стыков, которые герметизируют две половины переборок (рис. 1B, 2F).Насколько нам известно, такая организация беспрецедентна для поляризованных ячеек. Вполне возможно, что Т-образное расположение плотных соединений могло происходить от соединений, продольных вдоль канальца (горизонтальная полоса в Т) и застегивающихся вверх вдоль линии гребня (вертикальная полоса Т), либо снизу, либо со стороны Топ. Во-вторых, учитывая, что плотные контакты связаны с актиновыми филаментами, неудивительно, что переборки содержат F-actin поперек удлинения просвета. Присутствие F-actin в переборках д. Вносить анизотропию в апикальное поверхностное натяжение, приводя к образованию трубчатого, а не сферического просвета.Визуализация живых клеток показала, что структуры F-actin динамичны и адаптируемы и, следовательно, соответствуют требованиям растущей, ветвящейся и сливающейся BC сети in vivo . Сборка переборок потребует, чтобы мембрана была нанесена на апикальную поверхность, что может быть доставлено путем локальной секреции или рециркуляции из эндосомальной системы. В соответствии с таким требованием оборота мы наблюдали накопление пузырьков у основания переборок. В-третьих, с помощью целенаправленного скрининга РНКи установленных регуляторов полярности клеток мы обнаружили, что малая ГТФаза Rab35, регулятор рециклинга эндосом (Klinkert et al., 2016; Куранти и др., 2006; Mrozowska and Fukuda, 2016), необходим для формирования апикальных переборок и формы апикального просвета гепатоцитов.

В эпителиальных клетках Rab35 локализуется на апикальной и латеральной плазматической мембране (Kouranti et al., 2006) и функционально связан с поляризованным трафиком и организацией актина (Klinkert and Echard, 2016). В поляризующих гепатобластах Rab35 также обогащается апикальной плазматической мембраной, где образуются переборки. Однако, в то время как подавление Rab35 в цистах MDCK привело к инверсии полярности (Klinkert et al., 2016), это не вызывало потери или инверсии полярности в гепатобластах, но приводило к исчезновению переборок и переходу от полярности гепатоцитов к простой апико-базальной полярности. Эти результаты предполагают, что Rab35 лимитирует образование переборок в гепатоцитах. Основываясь на предыдущей работе над функцией Rab35 (Klinkert and Echard, 2016; Kouranti et al., 2006), мы предполагаем, что он может регулировать внутриклеточное распределение и функцию апикальных рециклирующих эндосом для доставки трансмембранных белков, например.грамм. компоненты соединения, в месте зарождения и / или роста переборок. Присутствие скоплений пузырьков у основания переборок, как визуализировано с помощью ЭМ, поддерживает эту точку зрения. Однако известно, что Rab35 координирует перенос мембран с организацией актинового цитоскелета (Chua et al., 2010; Klinkert and Echard, 2016). Следовательно, Rab35 может регулировать зарождение и / или динамику F-актина на переборках. Для тестирования этих моделей потребуется ряд подходов, в том числе использование преимуществ предыдущих исследований генов, регулирующих полярность гепатоцитов.Было показано, что Lkb1 является частью молекулярного пути, включающего cAMP-Epac-MEK-AMPK, регулирующий формирование сети BC (Fu et al., 2010, 2011; Homolya et al., 2014; Woods et al., 2011). Сообщалось, что Pard3, Par1b и различные клаудины влияют на полярность гепатоцитов, когда они истощены в различных клеточных линиях гепатоцитов (Can10, HepG2 и WIFB9) и первичных взрослых гепатоцитах (Grosse et al., 2013; Slim et al., 2013 ; Son et al., 2009; Wang et al., 2014). Таким образом, функция этих генов должна быть пересмотрена в контексте переборок и анизотропии удлинения просвета.Будет важно изучить роль актинового цитоскелета, например, с помощью различных лекарств, при условии, что они не нарушают полярность и не вызывают плейотропные цитотоксические эффекты. Роль Rab35 может быть опосредована его известными эффекторами, регулирующими актиновый цитоскелет (например, MICAL1 и OCRL; Chaineau et al., 2013; Dambournet et al., 2011; Frémont et al., 2017) или неизвестными гепатоцит-специфическими эффекторами. В этом отношении анализ транскриптомики выявил большое количество генов-кандидатов, дифференциально экспрессируемых в гепатоцитах по сравнению склетки желчных протоков и регулируются в большую или меньшую сторону при молчании Rab35. Таким образом, изучение механизмов образования переборок потребует широкомасштабной экспериментальной стратегии.

Примечательно, что подавление Rab35 не только изменило морфологию просвета поляризующих гепатобластов in vitro , но также позволило нам реконструировать организацию развивающейся паренхимы печени, которая показала поразительное увеличение крупных трубчатых структур, напоминающих желчные протоки. Это означает, что нам удалось преобразовать полярность гепатоцитов в простую апико-базальную полярность также in vivo .Неожиданно, истощение Rab35 также изменяет приверженность гепатобластов клеткам желчных протоков и / или переключает гепатоциты на программу клеток желчных протоков, хотя и не полностью. Некоторые клетки сохраняют черты гепатоцитов, тогда как др. Действительно экспрессируют маркеры клеток желчных протоков, но не Sox9, необходимые для образования ресничек. Мы не можем определить, влияет ли подавление Rab35 прямо на судьбу клеток желчных протоков, или это является следствием изменения полярности клеток. Одна из возможностей состоит в том, что морфология просвета определяется поляризующими гепатобластами, например.грамм. через механочувствительный путь, который отвечает за программу транскрипции клетки. Интересно, что в нейроэпителии сетчатки и поджелудочной железы решением судьбы клеток можно было управлять, изменяя размер апикального домена, что отражалось на активности сигнального пути Notch (Clark et al., 2012; Löf-Öhlin et al., 2017 ). Помимо Rab35, другие хорошо изученные белки клеточной полярности Crb3 и Cdc42 могут прямо или косвенно влиять на судьбу клеток-предшественников (Szymaniak et al., 2015, Кесаван и др., 2009). В то время как Crb3 регулирует клеточную судьбу эпителиальных клеток дыхательных путей путем прямого взаимодействия с компонентами пути Hippo (Szymaniak et al., 2015), Cdc42 играет неавтономную клеточную роль в спецификации предшественников поджелудочной железы, контролируя их окружающее микроокружение.

Наши данные представляют собой еще один пример сложного взаимодействия между полярностью клеток, решением судьбы клеток и механизмами самоорганизации ткани, а также дают новое понимание организации ткани печени как в процессе развития, так и у взрослых.Апикальные переборки, по-видимому, являются отличительной чертой гепатоцитов и сети РМЖ. Динамика апикальных переборок и роль актиновых филаментов и ассоциированных факторов будет иметь решающее значение для выяснения взаимодействия между клеточным морфогенезом и механикой клеток и тканей. Кроме того, переборки могут служить горячими точками сократимости для облегчения оттока желчи, как показано in vivo (Meyer et al., 2017; Watanabe et al., 1991). Переборки на судах также могут действовать как (полу) водонепроницаемые отсеки для предотвращения просачивания воды в другие части судна.Точно так же в BC они могут действовать как клапаны, обеспечивающие направленность потока желчи при неперистальтической сократимости. Понимание их структуры и функции, таким образом, предоставит новую информацию о роли актомиозиновой системы в регуляции потока желчи в сети BC.

Вклад авторов

Концептуализация, M.Z., L.B. и Ю.К .; Методология, L.B., J.D. and S.S .; Расследование, L.B., U.R., J.D., S.S., J.I.V., C.F. и H.R .; Программное обеспечение, E.G., H.M-N. и J.I.V; Формальный анализ, L.B., U.R., E.G., H.M-N., J.I.V, C.F. и Ю.К .; Ресурсы, Т.З., Э.С., Т.П., В.К. и M.V .; Визуализация, L.B., U.R., E.G., M.V., J.I.V., H.M-N., C.F. и Ю.К .; Validation, L.B .; Письмо — Эскизный, ЛБ .; Письмо — рецензирование и редактирование, М.З. и Ю.К .; Финансирование, М.З.

Декларация интересов

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Названия и легенды дополнительных рисунков

A) Один поляризующий дифференцирующийся гепатобласт, образующий множественные трубчатые просветы.Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок S1A.

B) BC Сеть растет между соседними клетками за счет слияния и разветвления (отмечено звездочкой) удлиненного трубчатого просвета. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок S1B.

C) Просвет, образованный между двумя клетками, начинает расти сферически, но позже корректируется и продолжает удлиняться, как типичный просвет BC. Шкала шкалы: 10 мкм. См. Также видео рисунок S1C.

A) Понижающая регуляция окклюдина нарушает формирование просвета в дифференцирующих и поляризующих гепатобалстах.Иммунофлуоресцентные изображения клеток, окрашенных на апикальный маркер CD13 и окклюдин. Шкала шкалы: 10 мкм.

B) Понижающая регуляция протеина плотных контактов ZO-1 нарушает формирование просвета у дифференцирующихся и поляризующих гепатобальтов. Иммунофлуоресцентные изображения клеток, окрашенных на ZO-1. Шкала шкалы: 10 мкм.

C) Понижающая регуляция Cdc42 приводит к сферическому просвету вместо BC в поляризующих гепатобластах. Полярность не нарушается, поскольку апикальные маркеры CD13 и ZO-1 все еще локализуются в сформированном просвете.Шкала шкалы: 10 мкм.

D) Понижающая регуляция Rab35 приводит к глубоким изменениям морфологии просвета поляризующих и дифференцирующихся гепатобластов. Клетки образуют многоклеточные структуры с общим просветом, положительным по апикальным маркерам CD13 и ZO-1. Иммунофлуоресцентные изображения клеток, обработанных тремя различными олигонуклеотидами миРНК. Шкала шкалы: 10 мкм.

E) Оценка эффективности нокдауна шести миРНК, разработанных для нацеливания на мРНК Rab35 через 96 часов после трансфекции в дифференцирующихся и поляризующих гепатобластах in vitro (n = 2, стандартное отклонение).

A) Схематический обзор экспериментов с инъекциями in utero .

B) Микроскопические изображения, показывающие подавление GFP в печени мышей, экспрессирующих GFP, посредством инъекции in utero LNP-siGFP по сравнению с печенью, инъецированной контрольным LNP-siLuc. Шкала шкалы: 30 мкм.

C) Изображения иммунофлуоресцентной микроскопии печени, инъецированной LNP-siRab35 и окрашенной на HNF4a (желтый) и Sox9 (пурпурный).Шкала шкалы: 30 мкм.

Звездные методы

Контактное лицо

Дополнительную информацию и запросы на ресурсы и реагенты следует направлять и выполнять Контактное лицо для ведущих специалистов, Marino Zerial (zerial {at} mpi-cbg.de).

Доступность материалов

Все уникальные / стабильные реагенты, созданные в этом исследовании, доступны у ведущего контактного лица с заполненным соглашением о передаче материалов.

Доступность данных и кода

Данные массового секвенирования РНК будут депонированы в NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) под номером доступа GEO после принятия.Код для скриптов будет доступен после принятия.

Экспериментальная модель и детали объекта

Животные и обращение с животными

Эксперименты на животных проводились в соответствии с немецким законодательством о защите животных в условиях отсутствия патогенов в помещении для животных MPI-CBG, Дрезден, Германия. Мышей содержали в общепринятом помещении с барьерными животными в условиях контролируемого климата в цикле 12 часов света / 12 часов темноты, кормили ad libitum обычным кормом для грызунов.Протоколы были одобрены институциональным инспектором по защите животных (Tierschutzbeauftragter), а необходимые лицензии были получены от региональной комиссии по этике экспериментов на животных Дрездена, Германия (Tierversuchskommission, Landesdirektion Dresden).

Для выделения первичных гепатобластов эмбриональную печень собирали у беременных (E13.5-E14.5) мышей дикого типа C57BL / 6JOlaHsd (Harlan Laboratories / Envigo, США) или C57BL6 / JRj (Janvier Labs, Франция). или трансгенные линии LifeAct-EGFP (Riedl et al., 2010), ROSAmT / mG (Muzumdar et al., 2007) или скрещивание двух трансгенных линий. Для экспериментов по инъекции in utero LNP, GFP-экспрессирующие эмбрионы были получены путем скрещивания ROSAmT / mG самки с самцом PGKCre (J) (Lallemand et al., 1998). Трансгенным эмбрионам или эмбрионам дикого типа инъецировали in utero через желточную вену на E13.5 и собирали печень на E16.5 — E17.5.

Первичные гепатоциты

Первичные гепатоциты выделяли от самцов мышей 8-12 недель в соответствии с установленным протоколом (Klingmüller et al., 2006) и немедленно обработали для выделения РНК.

Клеточная линия Chol / L

Клеточная линия больших холангиоцитов (клеток желчных протоков) (Ueno et al., 2003) культивировалась в виде монослоя или в капле 100% матригеля в среде DMEM + GlutaMAX с высоким содержанием глюкозы (Кат. № 31966, Gibco), 5% FBS (инактивированный нагреванием), 10 мМ HEPES, 1x NEAA (Кат. № 11140-050, Gibco).

QBI-239A

Клеточную линию культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (каталожный № 41966-029, Gibco) с 5% FBS (инактивированный нагреванием) и использовали для продуцирования аденовируса.

Подробности метода

Выделение Dlk + гепатобластов

Гепатобласты выделяли в виде фракции Dlk + с использованием магнитного разделения клеток. Протокол был адаптирован из Tanimizu et al. (2003) с некоторыми изменениями. Беременных мышей (E13.5-14.5) умерщвляли смещением шейных позвонков. 16-24 эмбриональной печени собирали, фрагментировали и инкубировали в среде для перфузии печени (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер 17701-038) в течение 20 минут на водяной бане при 37 ° C. Кусочки печени переваривали в среде Liver Digest Medium (Thermo Fisher Scientific, Cat.№ 17703-034,) с добавлением 10 мкг / мл ДНКазы I (каталожный № DN25, Sigma-Aldrich) в течение следующих 20 мин. Эритроциты лизировали в буфере для лизиса эритроцитов (155 мМ NH ₄ Cl, 10 мМ KHCO ₃ , 0,1 мМ Na ₄ EDTA, pH 7,4). Переваренные клетки инкубировали с блокирующими антителами Крысиные антитела против мышиного CD16 / CD32 (BD Biosciences, кат. № 553142, 1: 100) в течение 10 мин, затем с анти-Dlk mAb-FITC (MBL, кат. № D187-4). , 1:40) еще 15 мин. После промывания буфером (0,5% BSA, 2 мМ EDTA в PBS) клетки инкубировали с Anti-FITC MicroBeads (Miltenyi Biotec, Cat.№ 130-048-701, 1:10) в течение 15 мин и разделяют на магнитной колонке (Miltenyi Biotec, № по каталогу 130-024-201) согласно протоколу производителя.

Культивирование и дифференциация гепатобластов

Лунки для культур предварительно покрывали матригелем (BD Biosciences, кат. № 356231, 10% матригель в PBS) в течение 30 минут при 37 ° C и промывали PBS. Клетки, обогащенные Dlk +, высевали в среду для разложения (DMEM / F-12, добавка lutaMAX ™ (ThermoFisher, каталожный № 31331028), 10% FB, 1 ITS-X (Gibco, Cat.№ 51500-056), 0,1 мкМ дексаметазона (Sigma-Aldrich, кат. № D1756-25MG), 10 мМ никотинамида (Sigma-Aldrich, кат. № N0636-100G), 10 нг / мл человеческого HGF (in- домашнее производство), 10 нг / мл EGF мыши (собственное производство). В 96-луночные планшеты клетки высевали при плотности 13 000 клеток / лунку, в 24-луночные планшеты — при плотности 60 000 клеток / лунку. Через 24 часа клетки покрывали средой для дифференцировки (MCDB131, без глутамина (Gibco, кат. № 10372019), 5% FBS, 2 мМ L-глутамина (ThermoFisher, кат. №M11-004), 1x ITS-X (Gibco, кат. № 51500-056), 0,1 мкМ дексаметазона (Sigma-Aldrich, кат. № D1756-25MG)), содержащий матригель до конечных 5%. Клетки культивировали в течение 5 дней при 37 ° C, 5% CO ₂ с одной дополнительной заменой среды для дифференцировки. Dlk + клетки печени E14.5 содержали ~ 10% клеток, положительных по маркеру клеток желчных протоков Sox9, и использовались в экспериментах для оптимизации роста кист желчных протоков. Для других экспериментов использовали клетки Dlk + из печени E13.5, поскольку все клетки дали начало гепатоцитам с BC в вышеуказанных условиях культивирования.

Покадровая микроскопия живых клеток

Для видеомикроскопии живых клеток линии мышей LifeAct-EGFP (Riedl et al., 2010) и ROSAmT / mG (Muzumdar et al., 2007) были скрещены, и эмбрионы EGFP + были скрещены. собраны для выделения lk + клеток. Клетки lk + высевали (трансфицировали si NA) и отображали с 3-го дня культивирования на эпифлуоресцентном микроскопе Zeiss Axiovert 200 M с инкубатором (37 ° C, 5% CO ₂ ) с использованием 20-кратного объектива (NA 0,5. ) с 10-минутными интервалами в течение примерно 52 часов.Для визуализации локализации EGFP-Rab35 клетки Dlk + выделяли из эмбрионов ROSAmT / mG и трансдуцировали рекомбинантным аденовирусом (AdenoEGFP-Rab35) на 2 день культивирования. Клетки были визуализированы на 3-й день с 5-минутными интервалами до 24 часов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная визуализация

Культивируемые клетки фиксировали 3% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре, промывали 3 раза PBS, пропитывали 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут при комнатной температуре и блокировали 0,5% FBS в PBS не менее 30 мин при комнатной температуре.Первичные антитела разводили в блокирующем растворе, крысиных моноклональных анти-CD13 (Novus, кат. № NB100-64843, 1: 500), кроличьих поликлональных анти-ZO-1 (Thermo Fisher Scientific, кат. № 40-2200, 1: 200), крысиный моноклональный анти-Цитокератин 19 (Sigma-Aldrich, кат. № MABT913, 1: 500) и козий поликлональный анти-альбумин (Novus, кат. № NB600-41532, 1: 200) и инкубировали. 1 час при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C. Вторичные антитела (и / или красители фаллоидин-Alexa (Thermo Fisher Scientific, 1: 250) и DAPI (1 мг / мл, 1: 1000)) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.Для окрашивания кроличьими поликлональными антителами к Rab35 (Antibody Facility MPI-CBG Dresden, h36952, 1: 1000) клетки пермеабилизировали 0,05% сапонином и вместо этого блокировали 3% BSA в PBS. Наконец, клетки промывали PBS и отображали на лазерных сканирующих конфокальных микроскопах Olympus Fluoview 1000 (объективы 40x / 0,9 / воздух, 60x / 1,2 / вода), Zeiss LSM 700 (объективы 40x / 1,2 / вода, 20x / 0,8 / воздух).

Микроскопия локализации одиночных молекул

Эксперименты по микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM) были выполнены на микроскопе Nikon Eclipse Ti, который подробно описан в другом месте (Franke et al., 2019). Перед сбором образцы облучали в режиме эпифлуоресцентного освещения, чтобы перевести излучатели, которые были не в фокусе в схеме освещения HILO для сбора данных, в темное состояние. Продолжительность сбора данных была установлена ​​так, чтобы захватить большинство излучателей, то есть визуализация была завершена, когда было обнаружено лишь очень небольшое количество активных излучателей. Когда впервые была достигнута критически низкая плотность пятен, использовалась схема сбора данных из 1 кадра с низким возбуждением (активацией) 405 нм, за которым следуют 5 последовательных кадров с возбуждением 641 нм.Типичная длина сбора данных составляла 60000-200000 кадров с временем интегрирования 20 мс и возбуждением 641 нм. Стеки необработанных изображений были проанализированы с помощью rapidSTORM 3.2 (Wolter et al., 2012). FWHM был установлен как параметр свободной подгонки, но в пределах 275–650 нм, что соответствует начальному диапазону примерно 1 мкм (Franke et al., 2016), радиус окна подгонки был установлен равным 1200 нм, порог интенсивности до 1000 фотонов, в то время как для всех остальных параметров подгонки были сохранены значения по умолчанию в quickSTORM 3.2.Коррекция линейного бокового смещения была применена путем пространственно-временного совмещения отдельных структур друг с другом. Этому способствовало цветовое кодирование временной координаты с помощью встроенного инструмента.

Просвечивающая электронная микроскопия

In vitro культур гепатобластов, выращенных в 24-луночных планшетах, фиксировали добавлением теплого 2% -ного глутаральдегида в 200 мМ HEPES, pH 7,4 к культуральной среде в соотношении 1: 1 и инкубировали в течение 5 мин. при 37 ° С. Затем смесь фиксатора и среды заменяли добавлением свежего 1% глутарового альдегида в 200 мМ HEPES, pH 7.4, и образцы инкубируют при 37 ° C в течение еще 2 часов, затем при комнатной температуре в течение ночи. Для заливки смолы образцы пост-фиксировали 1% тетроксидом осмия и 1,5% феррицианидом калия в течение 1 часа на льду, затем контрастировали en-bloc 2% водным уранилацетатом в течение 2 часов при комнатной температуре, дегидратировали с помощью градуированной серии этанола: 70 -80-90-96%, каждый в течение 10 минут, и 4x 100%, каждый в течение 15 минут, постепенно пропитываются эпоксидной смолой LX-112 (Ladd Research Industries) и в конечном итоге полимеризуются при 60 ° C в течение 2 дней.Пластик пластины был отломан, чтобы высвободить смоляные диски с монослоем клеток с одной стороны. Диски разрезались на мелкие кусочки, которые были повторно установлены для продольной разрезки. Для сбора эмбриональной печени мыши беременную мышь умерщвляли и органы печени вырезали из эмбрионов и разрезали на несколько частей, которые фиксировали погружением 4% параформальдегидом в 200 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ CaCl ₂ в течение ночи. Перед заливкой смолы ткань печени разрезали на мелкие кусочки и дополнительно фиксировали 1% глутаровым альдегидом в 200 мМ HEPES, pH 7.4. Ткань обрабатывали, как описано выше, за исключением того, что для заливки использовали эпоновую смолу. Ткани были разрезаны случайным образом.

Последовательные 90-нм тонкие срезы были вырезаны с использованием ультрамикротома Leica Ultracut UCT и нанесены на покрытые формваром щелевые медные сетки. Срезы контрастировали 0,4% цитратом свинца в течение 1 мин и отображали в просвечивающем электронном микроскопе Tecnai T12 (ThermoFisher), работающем при 100 кВ и оборудованном аксиальной камерой CCD 2k (TVIPS).

Z-стек изображений последовательных срезов был выровнен с использованием плагина TrackEM2 на Фиджи (Cardona et al., 2012). Апикальную мембрану печени, просвет желчного канала и соединительный комплекс сегментировали на выровненных стопках изображений с помощью IMOD (Kremer et al., 1996) и Blender (Blender, 2010), чтобы реконструировать трехмерную модель.

Дизайн миРНК, синтез, трансфекция

Дизайн миРНК был выполнен с использованием собственного программного обеспечения, сначала путем тестирования всех доступных последовательностей на специфичность в отношении мишени в транскриптоме мыши (RefSeq в Pubmed) с последующим удалением последовательностей со значительной комплементарностью к миРНК мыши, содержание GC ниже 25% и выше 75% и иммунно-чувствительные (такие как UGU, UGUGU и т. д.). Кроме того, последовательности были отфильтрованы с использованием правил Рейнольдса (Reynolds et al., 2004). Шесть миРНК с наивысшей оценкой функциональности были отобраны и синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом, очищены с помощью IE-HPLC и проверены с помощью LC-MS (Farzan et al., 2017). Пиримидины в смысловой цепи и перед A в антисмысловой цепи (UA, CA динуклеотиды) были 2′-O-метилированы (показаны строчными буквами в последовательности), и обе цепи были 3′-модифицированы дитимидилатом фосфоротиоата (TsT) для усиления стабильность нуклеаз.Рабочие растворы получали разбавлением миРНК до 10 мкМ в 10 мМ Tris.HCl, pH 7,5. siRNA трансфицировали с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine ™ RNAiMAX (Thermo Fisher cientific, Cat. No. 13778075) в соответствии с протоколом обратной трансфекции, предоставленным производителем. Конечная концентрация на лунку составляла 10 нМ si NA и 0,1 об.% Lipofectamine ™ NAiMAX.

Экстракция белка и вестерн-блоттинг

Культивируемые клетки лизировали в течение 20 мин в ледяном буфере для лизиса SDS (20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1% SDS, 1% NP-40 (IGEPAL CA-630), недавно добавленный 1/1000 CLAAAP (химостатин, лейпептин, антипаин, апротинин, APMSF, пепстатин), 1/100 коктейль ингибиторов фосфатазы 2 и 3 (Sigma Aldrich). Для каждого условия пять лунок 96-луночного планшета объединяли вместе в 125 мкл буфера для лизиса SDS. Лизаты обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут и центрифугировали при 13000 x g в течение 10 минут, 4 ° C. Концентрацию белка измеряли с помощью DC ™ Protein Assay (Bio-Rad, № по каталогу 500-0116).Образцы разделяли на 15% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали и инкубировали с первичными антителами кроличьего поликлонального анти-Rab35 (Antibody Facility MPI-CBG Dresden, F18256, 1: 1000) и мышиным моноклональным анти-γ-тубулином (Sigma-Aldrich, каталожный № T6557, 1: 2000). и вторичные HPR-конъюгированные антитела (1: 10000) в 5% сухом молоке, 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 200 мМ NaCl, 0,1% Tween20. Связанное антитело детектировали с помощью набора для определения вестерн-блоттинга CL ™ (GE Healthcare, Cat.№ RPN2209) на Hyperfilm ECL (Amersham GE Healthcare). Количественная оценка вестерн-блоттинга проводилась с помощью Image J (Miller, 2010), статистические данные рассчитывались, а графики строились в R (R Development Core Team, 2008).

Выделение РНК и RT-qPCR

Тотальную РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, кат. № 74104 50), включая стадию обработки ДНКазой I (Qiagen, кат. № 79254). Клетки лизировали RTL-буфером с добавлением DTT. кДНК синтезировали с использованием набора ProtoScript®II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB, Cat.No. E6560S) в соответствии с протоколом производителя с использованием Andom Primer Mi и стадией денатурации NA. КПЦР выполняли на Roche LightCycler® 96 в реакциях объемом 10 мкл с использованием FastStart Essential DNA Green Master (Roche, № по каталогу 06402712001). Ген домашнего хозяйства Rplp0 использовали в качестве эндогенного эталонного гена. Нормализованное значение относительной экспрессии генов и% нокдауна рассчитывали с использованием метода ΔΔCq (Haimes and Kelley, 2010), рассчитывали статистику и строили графики в R (R Development Core Team, 2008).

Массовое секвенирование РНК

Было проведено два независимых эксперимента. Для эксперимента A были собраны следующие четыре образца в 4 биологических повторностях: E14.5 Dlk + гепатобальсты, выделенные и немедленно обработанные для выделения РНК, in vitro, дифференцированных гепатоцитов из E14.5 Dlk + гепатобластов, дифференцированных в течение 4 дней в среде для дифференцировки с 4% Matrigel. выращенные на фибронектиновом покрытии зрелые гепатоциты, выделенные из взрослых мышей-самцов в соответствии с опубликованными протоколами (Klingmüller et al., 2006) и сразу же обработали для выделения РНК. Клеточную линию Chol / L выращивали в виде монослоя или трехмерной кисты в каплях 100% матригеля до тех пор, пока поляризация не становилась видимой за счет надлежащей локализации апикальных и латеральных маркеров, а затем обрабатывали для выделения РНК. Для эксперимента B образцы в 3 биологических повторах были собраны из in vitro культивированных гепатобластов E13.5 Dlk +, трансфицированных siRNA, нацеленной на Rab35 (siRNA # 4), или контрольной люциферазы без нацеливания (siLuc) на 5-й день культивирования. .Нокдаун мРНК Rab35 подтверждали с помощью RT-qPCR. Целостность РНК измеряли с помощью биоанализатора Agilent 2100. Предпочтительно использовали только образцы с числом целостности РНК (RIN)> 9,0. 1 мкг (эксперимент A) или 300 нг (эксперимент B) мРНК выделяли из общей РНК путем обогащения poly-dT с использованием модуля магнитной изоляции NEBNext Poly (A) мРНК в соответствии с инструкциями производителя. Окончательную элюцию проводили в 15 мкл 2 буфера для синтеза первой цепи c NA (NEBnext, NEB). После химической фрагментации путем инкубации в течение 15 минут при 94 ° C образец непосредственно подвергали рабочему процессу для подготовки библиотеки специфичных для цепей РНК-Seq (эксперимент A: N BNe t® Ultra ™ NA Library Prep Kit для Illumina®, эксперимент B: N BNe t® Ultra ™ II Directional RNA Library Prep Kit для Illumina®).Для лигирования использовались специальные адаптеры (Адаптер-Oligo 1: 5′-ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT-3 ‘, Адаптер-Oligo 2: 5’-P-GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT САС-3 ‘). После лигирования адаптеры истощали очисткой гранул XP (Beckman Coulter), добавляя гранулы в соотношении 1: 1. Индексирование выполняли во время следующего обогащения ПЦР (15 циклов, 65 ° C) с использованием пользовательских праймеров для амплификации, несущих последовательность inde, обозначенную «NNNNNN». (Праймер 1: Oligo_Seq AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T, праймер 2: GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC T, праймер 3: CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA NNNNNN GTG ACT GGA GTT.После еще двух очисток гранул XP (1: 1) библиотеки количественно оценивали с использованием набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). Для производства проточных ячеек Illumina образцы были эквимолярно объединены и распределены по всем дорожкам, используемым для секвенирования с однократным считыванием 75 п.н. на Illumina HiSeq 2500 (или Illumina NextSeq 500 для эксперимента B), что привело в среднем к 30 (или 33 для эксперимента B) секвенированным фрагментам. за образец.

Эксперименты по продуцированию и спасению рекомбинантного аденовируса

Рекомбинантный аденовирус для экспрессии слитого с EGFP Rab35 (кДНК RAB35 человека, вариант транскрипта 1 (NM_006861.7)) был получен с использованием векторной системы AdEasy ™ (Qbiogen), разработанной (He et al., 1998). Линкер GGGGSGGGGS был введен между EGFP и RAB35. Фрагмент RAB35 с линкерным удлинением амплифицировали из плазмиды Addgene # 47424, подаренной Питером Макферсоном (Allaire et al., 2010), и субклонировали в вектор pEGFP-C3 (Clontech) с использованием сайтов рестрикции ScaI и BamHI. Фрагмент EGFP-линкер-RAB35 клонировали в вектор-переносчик pShutle-CMV (система векторов AdEasy, Qbiogen) с использованием сайтов рестрикции SalI и HindIII.Рекомбинантный вектор переноса линеаризовали с помощью PmeI и трансформировали в электрокомпетентный E . coli штамм BJ5183-AD-1 (Stratagene, Кат. № 200157-11) для рекомбинации in vivo с вектором pAdEasy. Положительный клон амплифицировали в E.coli DH5α и линеаризовали с помощью PacI перед трансфекцией в упаковывающую клеточную линию QBI-293A (производное клеток Qbiogen HEK-293A). Вирус амплифицировали и очищали с помощью OptiPrep-gradient (раствор йодиксанола 60 мас. / Об.%, Axis Shield, Cat.No 1114542). Аналогичным образом получали контрольный вирус, содержащий только EGFP.

E13.5 Dlk + гепатобласты засевали и трансфицировали, как описано выше, с помощью миРНК Luc или миРНК Rab35 №4. 72 часа спустя клетки инфицировали рекомбинантным аденовирусом (EGFP или EGFP-Rab35) в разведении 1/1000 и 1/100 соответственно. Клетки культивировали еще 2 дня, фиксировали и окрашивали Phalloidin-Alexa 647 и DAPI. По полученным изображениям количественно оценивали «спасение» фенотипа просвета.

Для использования in vivo олигонуклеотиды siRNA были преобразованы в липидные наночастицы (LNP) с липоидом C12-200, как описано ранее (Love et al., 2010). siRNA-LNPs были доставлены in utero в эмбриональную печень E13.5 через желточную вену, как описано в другом месте (Ahn et al., 2018). Мы оптимизировали концентрацию siRNA-LNP до 5 мг / кг массы тела и продолжительность лечения до 4 дней с использованием siRNA-LNP, нацеленных на мРНК GFP (Gilleron et al., 2013) в эмбрионах ROSAmG (полученных от скрещивания ROSA mG / mT x PGKCre (J) линий). Вес эмбрионов оценивался на основании опубликованных результатов (Kulandavelu et al., 2006). Вкратце, беременных мышей анестезировали в наркозном боксе изофлураном 5%, затем помещали на нагретый столик, прикрепленный к наркозной маске с потоком изофлурана в количестве 2-3%.Анальгезия обеспечивалась инъекцией 4 мг / кг метамизола непосредственно перед операцией и поддерживалась добавлением 1,33 мг / мл того же препарата в питьевую воду до умерщвления. Брюшко мышей брили, а затем стерилизовали этанолом; защищать глаза от высыхания увлажняющим кремом. Матку обнажили вертикальной лапаротомией. Затем эмбрионам вводили 5 мкл LNP в дозе 5 мг / кг. Успех инъекции оценивали по клиренсу крови из целевого сосуда. Эмбрионы одной и той же матери были случайным образом распределены как неинъектированные, инъецированные контрольной миРНК или инъецированные нацеливающей миРНК.Инъекции выполнялись вытянутыми иглами из стеклянных капилляров, помеченных вручную. После инъекций эмбрионы помещали обратно в брюшную полость и брюшную полость закрывали наложением швов. Затем эпидермис закрывали хирургическими зажимами. В конце операции мышей помещали рядом с нагревательной лампой и наблюдали до полного пробуждения. Печень собирали на E17.5.

Окрашивание ткани печени с оптическим просветом

Эмбриональную печень фиксировали погружением в PFA (4% PFA, 0.1% Tween20, PBS) в течение 2 часов при комнатной температуре и в течение ночи при 4 ° C. PFA нейтрализовали инкубацией в течение ночи в 50 мМ NH ₄ Cl в PBS. Позднее печень хранили в PBS при 4 ° C до обработки. Печень помещали в 4% легкоплавкую агарозу в PBS и разрезали на срезы толщиной 100 мкм на вибратоме (Leica VT1200S). Для визуализации глубоких тканей срезы тканей были проницаемы с помощью 0,5% TtitonX100 в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела крысиные моноклональные анти-CD13 (Novus, NB100-64843, 1: 500) и кроличьи моноклональные анти-Sox9 (Abcam, Cat.№ ab185966, 1: 500) разводили в буфере Tx (0,2% желатин, 300 мМ NaCl, 0,3% Triton X-100 в PBS) и инкубировали в течение 2 ночей при комнатной температуре. После отмывки 5 x 15 мин 0,3% TtitonX-100 в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами осла против крысы 568 (BIOTIUM, каталожный № 20092, 1: 1000), ослиными антителами против кролика 647 (Thermo Fisher Scientific , Кат. № A31573, 1: 1000) и DAPI (1 мг / мл, 1: 1000) и Phalloidin-Alexa488 (Thermo Fischer Scientific, Кат. № A12379, 1: 150) еще на 2 суток проживания.После отмывки 5 x 15 мин 0,3% TtitonX-100 в PBS и 3 x 1 мин с PBS, оптическая очистка началась с инкубации срезов в 25% фруктозе в течение 4 часов, продолжалась в 50% фруктозе в течение 4 часов, 75% фруктозе. в течение ночи 100% фруктозы (100% мас. / об. фруктозы, 0,5% 1-тиоглицерина, 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,5) в течение 6 часов и, наконец, в течение ночи в растворе SeeDB (Ke et al., 2013) (80,2% мас. / мас. фруктоза, 0,5% 1-тиоглицерин, 0,1 М фосфатный буфер). Образцы были смонтированы в SeeDB.

Количественная оценка и статистический анализ

Трехмерная реконструкция желчных каналов

Оптически очищенные срезы печени размером 100 мкм были получены с помощью вертикального многофотонного лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss LSM 780 NLO), оборудованного детекторами на основе фосфида арсенида галлия (GaAsp).Срезы печени были визуализированы дважды при низком (объектив Zeiss 20x / 0,8) и высоком разрешении (объектив Zeiss 63x / 1,3, размер вокселя 0,3 мкм) соответственно. Были созданы обзоры с низким разрешением полных срезов печени, которые использовались для выбора областей, в которых были очевидны увеличенные апикальные мембраны. Выбранные области (~ 300 мкм x 300 мкм x 100 мкм; x, y, z) затем были получены с высоким разрешением. Изображения с высоким разрешением были обработаны и сегментированы желчные каналы на основе окрашивания CD13 с помощью программного обеспечения отслеживания движения, как описано (Morales-Navarrete et al., 2015; Моралес-Наваррете и др., 2016). Распределение локального радиуса просвета рассчитывалось исходя из максимального радиуса 10 мкм.

Для сегментации клеток выбранная область изображения (∼70 мкм x 70 мкм x 60 мкм; x, y, z) была удалена с помощью метода PURE-LET (Luisier et al., 2010), то есть через ‘ Плагин Pure enoise ‘в ImageJ с Cycle-spin = 10 и Multiframe = 11. Затем затенение и неравномерное освещение были исправлены с помощью алгоритма BaSiC (Peng et al., 2017) и плагинов Rolling Ball Background Subtraction на Фиджи соответственно.Предварительно обработанное изображение было импортировано в систему отслеживания движения, и апикальные мембраны были реконструированы, как описано выше. Клетки, окружающие апикальную трубку, были сегментированы с использованием подхода трехмерной активной сетки с окрашиванием фаллоидином в качестве маркера границы клеток, как описано в (Morales-Navarrete et al., 2015).

Количественная оценка радиуса просвета

Для количественной оценки эффекта подавления Rab35 и восстановления Rab35 на морфологию просвета in vitro для FIJI был написан специальный сценарий для сегментации просвета на микроскопических изображениях на основе сигнала актина (Phalloidin-Alexa 647) и извлечь статистику по региону.Для эксперимента по спасению маска сегментации была настроена так, чтобы для анализа оставались только просветы с минимальным (70%) перекрытием с каналом GFP (экспрессируемый белок) (клетки, которые фактически экспрессируют белок). В скрипте была пауза для проверки сегментации и ручного исправления. Для количественного определения радиуса просвета мы использовали в качестве дескриптора «локальную толщину», которую можно вычислить с помощью плагина Fiji (https://imagej.net/Local_Thickness). Локальная толщина в любой внутренней точке объекта определяется как диаметр наибольшего круга, который содержит точку и полностью входит в объект.Для каждого просвета рассчитывалась гистограмма локальной толщины, а также средняя локальная толщина.

Затем была нормализована гистограмма локальной толщины каждого объекта. Чтобы учесть различный размер объектов, каждая нормализованная гистограмма была умножена на весовой коэффициент w _i , который пропорционален предполагаемому объему объекта i. Не теряя общности, мы определили, где A _i — количество пикселей, принадлежащих объекту.Затем гистограммы всех объектов на каждом изображении были суммированы и нормализованы (то есть, чтобы исключить влияние различий в общем количестве апикальной мембраны между изображениями). Наконец, представлены усредненные гистограммы (сначала по разным изображениям, а затем между разными экспериментами N = 3). Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего (SEM) на ячейку. Количественная оценка гистограммы была выполнена с использованием MATLAB R2020b.

Дифференциальный анализ экспрессии генов

Базовый контроль качества исходных данных секвенирования был выполнен с помощью FastQC v0.11.2 (Эндрюс, 2010). Считывания были сопоставлены с эталонной сборкой генома мыши GRCm38, а гены Ensembl release v92 (Zerbino et al., 2018) были количественно определены с использованием STAR v2.5.2b (Dobin et al., 2013). На основании уровня дублирования считывания, оцененного с помощью MarkDuplicates из инструментов Picard v2.10.2 (Broad Institute, 2018) и dupRadar v1.8.0 (Sayols et al., 2016), реплика 3 образца клеточной линии Chol / L (3D-кисты ) был идентифицирован как выброс и удален из набора данных «Эксперимент А». Данные подсчета оставшихся образцов были отфильтрованы для генов с более чем 10 отсчетами в любом из образцов и служили входными данными для DESeq2 v1.22.2 (Love et al., 2014) для идентификации дифференциально экспрессируемых генов с использованием порога log2-кратного изменения, равного 1, и скорректированного порогового значения p-значения 0,01. Анализ дифференциальной экспрессии генов набора данных «Эксперимент B» был выполнен с использованием DESeq2 v1.18.1 с использованием порога изменения log2fold, равного 0,5. Мы скорректировали эффект партии из-за разных дней пробоподготовки. Тепловая карта и график вулкана были созданы с использованием пакетов R gplots (функция heatmap.2) и EnhancedVolcano соответственно.

Анализ обогащения генетического набора (GSEA)

GSEA был проведен с использованием инструмента GSEAPreranked из программного обеспечения GSEA v4.1.0 (Mootha et al., 2003; Subramanian et al., 2005) с настройками по умолчанию. Для создания ранжированных списков генов для трех типов клеток применялся DESeq2 1.28.1 (Love et al., 2014). Списки генов были отфильтрованы для генов со значениями p <0,05, отсортированы в порядке убывания по их значениям log2FC и использованы в качестве входных данных для GSEA.

Дополнительное видео и таблицы

Видео Рисунок 1D: Образование BC in vitro

Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая образование BC между двумя дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.

Видео Рисунок 2F: Анимация упрощенной модели BC с переборками

Упрощенная модель BC, основанная на трехмерной реконструкции на рисунке 2E с периодическими переборками мембранных соединений, содержащих плотные соединения (красные), образованные сверху или снизу. дно просвета. Апикальная плазматическая мембрана просветообразующих клеток представлена ​​зеленым и синим цветом.

Видео Фигура 4B ’: Цисты, образованные при подавлении Rab35 in vitro

Конфокальный z-стек показывает множественные цистоподобные структуры, образованные при подавлении Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах in vitro .Клетки окрашивали на F-актин и ядра. Шкала шкалы: 30 мкм.

Видео Рисунок 5A: Формирование сферического просвета при подавлении Rab35 in vitro

Покадровая микроскопия живых клеток, показывающая рост сферического просвета между двумя дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP, при подавлении Rab35. Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.

Видео Рисунок 5B: Формирование многоклеточной кисты in vitro при замалчивании Rab35

Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая образование многоклеточной кисты при замалчивании Rab35 в дифференцирующихся гепатобластах, экспрессирующих LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.

Видео Рисунок 7CD: Трехмерная реконструкция просветной сети в печени, инъецированной LNP-siLuc или LNP-siRab35

Трехмерная реконструкция просвета, помеченного апикальным маркером CD13, в срезах ткани печени толщиной 100 мкм, инъецированных LNP-siLuc и LNP-siRab35. Сначала показано окрашивание CD13, затем трехмерная реконструкция на основе окрашивания. Вены показаны красным. Шкала шкалы: 30 мкм.

Видео Рис. 7F: Трехмерная реконструкция канальца, образованного в печени, инъецированной LNP-siRab35

Трехмерная реконструкция канальца, обнаруженного в печени, инъецированной LNP-siRab35.Сначала показано окрашивание CD13, затем восстановленный просвет зеленого цвета и, наконец, реконструированные клетки случайным цветом. Просвет окружен множеством клеток.

Доп. Видео S1: 3D-модель BC на основе данных ЭМ

Трехмерная реконструкция последовательных срезов ЭМ на рис. 2B на основе визуализации апикальных плазматических мембран и плотных стыков. Апикальная плазматическая мембрана клеток, образующих просвет, выделена зеленым и синим цветом, плотные контакты выделены красным.

Видео Рисунок S1A: Формирование множественных просветов BC одним дифференцирующимся гепатобластом

Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая формирование нескольких просветов BC одним дифференцирующимся гепатобластом, экспрессирующим LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.

Видео Рисунок S1B: Ветвление и слияние просвета BC

Покадровая микроскопия живых клеток ветвления и слияния просветов BC, образованных дифференцирующимися гепатобластами, экспрессирующими LifeAct-EGFP. Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.

Видео Рисунок S1C: Восстановление трубчатого просвета BC

Покадровая микроскопия живых клеток, документирующая переход сферического просвета в канальцевый просвет в дифференцирующихся гепатобластах, экспрессирующих LifeAct-EGFP.Изображения получены с 10-минутными интервалами. Шкала шкалы: 10 мкм.

Таблица S2 (раздел, связанный с методами): последовательности siRNA, используемые в исследовании

Таблица Excel

Благодарности

Мы благодарны Арно Эшарду за обсуждения и обмен реактивами. Мы благодарим докторов наук. Meritxell Huch, Elisabeth Knust, Kai Simons, Ivan Baines и Janelle Lauer за стимулирующие обсуждения и критическое прочтение рукописи.Мы благодарим Сандру Сегелец за то, что она поделилась своим опытом в производстве рекомбинантных аденовирусов и визуализации живых клеток, и Александру Калайдзиду за визуализацию. Мы благодарим Центр генома DRESDEN за услуги по массовому секвенированию РНК и за поддержку Light Microscopy Facility, ключевого компонента технологической платформы CMCB в Техническом университете Дрездена. Мы хотели бы поблагодарить следующие службы и объекты Института молекулярной клеточной биологии и генетики им. Макса Планка за их поддержку: центр по разработке антител, биомедицинские услуги, центр электронной микроскопии, центр световой микроскопии, центр экспрессии, очистки и характеристики белков (PEPC), и Научно-вычислительный центр, в частности, Лена Херсеманн и Норин Уокер.

Это исследование было выполнено при финансовой поддержке Федерального министерства исследований и образования Германии (BMBF) (LiSyM, номер гранта 031L0038), Европейского исследовательского совета (ERC) (номер гранта 695646), Deutsche Forschungsgemeinschaft (F, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегия передового опыта Германии — EXC-2068– 3961– Кластер передового опыта в области физики жизни Университета Дрездена и Общества Макса Планка (MPG).

С стартовой линии | Самопроизвольное расслоение коронарной артерии: учебник для общего кардиолога

«Доктор, что такое SCAD?»

Это была 39-летняя повторнородящая женщина, поступившая для оценки боли в груди, которая началась во время просмотра телевизора.Боль в груди описывалась как умеренная интенсивность, давление в груди за грудиной, усиливающееся при физической нагрузке. Никаких недавних лихорадок, озноба, диареи или факторов социального стресса. У нее не было факторов риска ишемической болезни сердца (ИБС), и у нее не было семейного анамнеза ранней ИБС. При поступлении ее жизненно важные показатели были стабильными.

Электрокардиограмма (ЭКГ) показала синусовый ритм без изменений ST-T, касающихся ишемии. Лабораторные исследования выявили повышенный уровень тропонина. Трансторакальная эхокардиограмма показала нормальную систолическую функцию левого желудочка (ЛЖ), нормальное движение стенки ЛЖ и отсутствие значимого порока клапана.Боль в груди исчезла с помощью нитроглицерина сублингвально.

Я сообщил ей, что меня беспокоит, что у нее SCAD (спонтанное расслоение коронарной артерии), и порекомендовал сделать коронарную ангиограмму. Моя пациентка и медсестра были удивлены, поскольку ни один из них не слышал о термине «SCAD».

Определение, эпидемиология, патофизиология